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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求长片段（7.5 kb）PCR扩增方法？
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lhl2225

金虫 (正式写手)

[求助] 求长片段（7.5 kb）PCR扩增方法？ 已有2人参与

目前手头有个工作，需要克隆一个基因的全长。
模板已经过测序，是没有问题的。

遇到问题：
1. 两端设计引物，试了LA taq，KOD，Taq等P不出来。
2.中间设计引物分段P，也P不出来。
3.直接在中间设计两条引物，随便P一段也P不出来。

急！！！

求高人指点！如果根据您的建议P出来了，将赠送100金币酬谢。
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1楼 2013-08-01 17:31:38
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模板的浓度？ 加的量呢？引物的量？酶的量？
你P不出来的胶图是什么样子的？
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2楼2013-08-01 19:03:39
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hyphen007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从模板、引物、反应条件等方面找原因
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3楼2013-08-01 19:27:55
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lhl2225

金虫 (正式写手)
20μL体系：
ddH2O： 14.5 μL
buffer：2
dNTP（2.5mM each）：1.6
F （10uM）：0.5
R（10uM）：0.5
模板：20 ng
rTaq：0.4

P不出来就是只见引物二聚体，无目的条带！
DMSO：0.2
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4楼2013-08-01 19:34:13
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-08-02 09:36:43
模板是gDNA, cDNA？PCR的程序是怎样的，引物的退火温度优化了没有？
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5楼2013-08-02 04:14:42
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lhl2225

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-08-02 04:14:42
模板是gDNA, cDNA？PCR的程序是怎样的，引物的退火温度优化了没有？

20μL体系：
ddH2O： 14.5 μL
buffer：2
dNTP（2.5mM each）：1.6
F （10uM）：0.5
R（10uM）：0.5
模板：20 ng 质粒
rTaq：0.4

P不出来就是只见引物二聚体，无目的条带！
DMSO：0.2
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我想做到的一定能成功！自信不是简单地渴望别人认可你，你要在内心深处觉得，我可以。这样就不用理会别人的怀疑或轻视。
6楼2013-08-06 08:50:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by lhl2225 at 2013-08-06 08:50:46
20μL体系：
ddH2O： 14.5 μL
buffer：2
dNTP（2.5mM each）：1.6
F （10uM）：0.5
R（10uM）：0.5
模板：20 ng 质粒
rTaq：0.4

P不出来就是只见引物二聚体，无目的条带！
DMSO：0.2...

质粒加20ng太多了，稀释100-1000倍再P
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7楼2013-08-06 11:07:11
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tmaclhf

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

长片段可以用两步PCR法。变性后直接来个65度8分钟
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8楼2013-08-06 11:12:45
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simojie

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

1. rTaq肯定没有LA-Taq效果好；
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厚积薄发
9楼2013-08-06 17:36:38
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huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

建议LZ用北京全式金的fast pfu，2-4kb/m
看样子，LZ的基因序列比较特别，估计是高GC或者是高AT的，如果是高GC的就加点高GC buffer.
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10楼2013-08-06 17:44:04
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