应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求长片段（7.5 kb）PCR扩增方法？
181/2返回列表12下一页
查看: 3322  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

lhl2225

金虫 (正式写手)

[求助] 求长片段（7.5 kb）PCR扩增方法？ 已有2人参与

目前手头有个工作，需要克隆一个基因的全长。
模板已经过测序，是没有问题的。

遇到问题：
1. 两端设计引物，试了LA taq，KOD，Taq等P不出来。
2.中间设计引物分段P，也P不出来。
3.直接在中间设计两条引物，随便P一段也P不出来。

急！！！

求高人指点！如果根据您的建议P出来了，将赠送100金币酬谢。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
我想做到的一定能成功！自信不是简单地渴望别人认可你，你要在内心深处觉得，我可以。这样就不用理会别人的怀疑或轻视。
1楼 2013-08-01 17:31:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模板的浓度？ 加的量呢？引物的量？酶的量？
你P不出来的胶图是什么样子的？
赞一下 回复此楼
2楼2013-08-01 19:03:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hyphen007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从模板、引物、反应条件等方面找原因
赞一下 回复此楼
3楼2013-08-01 19:27:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lhl2225

金虫 (正式写手)
20μL体系：
ddH2O： 14.5 μL
buffer：2
dNTP（2.5mM each）：1.6
F （10uM）：0.5
R（10uM）：0.5
模板：20 ng
rTaq：0.4

P不出来就是只见引物二聚体，无目的条带！
DMSO：0.2
赞一下 回复此楼
我想做到的一定能成功！自信不是简单地渴望别人认可你，你要在内心深处觉得，我可以。这样就不用理会别人的怀疑或轻视。
4楼2013-08-01 19:34:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-08-02 09:36:43
模板是gDNA, cDNA？PCR的程序是怎样的，引物的退火温度优化了没有？
赞一下 回复此楼
5楼2013-08-02 04:14:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lhl2225

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-08-02 04:14:42
模板是gDNA, cDNA？PCR的程序是怎样的，引物的退火温度优化了没有？

20μL体系：
ddH2O： 14.5 μL
buffer：2
dNTP（2.5mM each）：1.6
F （10uM）：0.5
R（10uM）：0.5
模板：20 ng 质粒
rTaq：0.4

P不出来就是只见引物二聚体，无目的条带！
DMSO：0.2
赞一下 回复此楼
我想做到的一定能成功！自信不是简单地渴望别人认可你，你要在内心深处觉得，我可以。这样就不用理会别人的怀疑或轻视。
6楼2013-08-06 08:50:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by lhl2225 at 2013-08-06 08:50:46
20μL体系：
ddH2O： 14.5 μL
buffer：2
dNTP（2.5mM each）：1.6
F （10uM）：0.5
R（10uM）：0.5
模板：20 ng 质粒
rTaq：0.4

P不出来就是只见引物二聚体，无目的条带！
DMSO：0.2...

质粒加20ng太多了，稀释100-1000倍再P
赞一下 回复此楼
7楼2013-08-06 11:07:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tmaclhf

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

长片段可以用两步PCR法。变性后直接来个65度8分钟
赞一下 回复此楼
8楼2013-08-06 11:12:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

simojie

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

1. rTaq肯定没有LA-Taq效果好；
赞一下 回复此楼
厚积薄发
9楼2013-08-06 17:36:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

建议LZ用北京全式金的fast pfu，2-4kb/m
看样子，LZ的基因序列比较特别，估计是高GC或者是高AT的，如果是高GC的就加点高GC buffer.
赞一下 回复此楼
10楼2013-08-06 17:44:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lhl2225 的主题更新
181/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +10 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 22/1100 2026-11-06 17:18 by 5sJFDKp2kwuI
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 7/350 2026-11-06 16:43 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 11/550 2026-11-06 16:32 by 5sJFDKp2kwuI
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:23 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 15/750 2026-11-06 13:49 by BkA9Bi5cMhkD
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +7 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 17/850 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +8 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +8 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 18/900 2026-11-06 13:36 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 12/600 2026-11-06 05:32 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 14/700 2026-11-06 05:11 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 14/700 2026-11-06 05:10 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 kvewwGtKktqB 2026-11-04 11/550 2026-11-06 05:10 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 kvewwGtKktqB 2026-11-04 16/800 2026-11-06 05:00 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +7 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 22/1100 2026-11-06 04:47 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-06 04:47 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 8/400 2026-11-06 02:24 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 9/450 2026-11-06 02:15 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 7/350 2026-11-06 02:13 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 02:04 by qL1cU46YIdK0
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-05 11:10 by PYZmcHr5kSaq
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭