应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 5kb大片段PCR扩增求助
191/2返回列表12下一页
查看: 3738  |  回复: 18
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看

yuqin1987

新虫 (初入文坛)

[求助] 5kb大片段PCR扩增求助

我用细菌DNA为模版扩增一5kb片段，用的TAKARA的PrimeSTAR HS DNA Polymerase，反应条件98℃ 5min，98℃ 45s（变性），56℃ 20s（退火），68℃ 5min（延伸），68℃ 8min。扩出来的条带很暗，浓度很低，无法用于后续实验，求助各位高手，多多指教！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验 代谢毒理细胞生物

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-07-23 09:56:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2012-07-25 16:29:27
1  使用高纯度的dNTP
2   做梯度试试
3  最后一步延伸时间增加到20min以上。
4  体系选择50 微，稳定性比20微好很多。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2012-07-24 14:22:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+2, 谢谢参与 2012-07-25 16:30:19
我认为可从以下几点改进：
1.加大dNTP量，可加倍
2.72℃延伸6min或7min
3.最后一步延伸10min以上
4.用50微升体系，楼上也说了，一旦扩出来，一管就够后面的实验了
5.还不行的话重新设计引物
我前几天才扩了一个8kb的片段，真难扩呀，且只有一次成功，第二天重复就没出来了，还好有两管成功，希望够后续试验用。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2012-07-25 06:24:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

love_st

金虫 (著名写手)
不如重新设计引物
赞一下 回复此楼
3楼2012-07-24 16:34:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
transgene fastpfu,72度延伸5Min,应该可以搞定
赞一下 回复此楼
4楼2012-07-24 22:14:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

litingwen

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做梯度PCR试验，延伸温度72° 5min试试
赞一下 回复此楼
5楼2012-07-24 22:27:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我以前扩12kb以上的片段也费了比较大的劲，而且用的都是质粒为模板，前两天我们一个老师用我的质粒为模板，用他自己生产的聚合酶，很轻松的扩增出了18kb，而且只用了20循环，延伸6min。建议使用
赞一下 回复此楼
人生百态原为海，看破红尘方为岸！
7楼2012-07-25 11:13:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议围绕TM值设计温度梯度PCR，延伸时间可以适当再延长1min。
建议反应条件：
98℃  5min
98℃  45s
温度梯度  20s
72℃  6min
72℃  10min
4℃  ——
25-30个循环。

温度梯度PCR之后选几个结果较好的切胶回收。如果一直都是这样，浓度很低，可以多P几管，回收的时候合在一起应该就够用了。
赞一下 回复此楼
8楼2012-07-25 11:22:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

vir2008

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以试一下同公司的LA Taq，扩增长片段效率会好些。
赞一下 回复此楼
9楼2012-07-25 12:59:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

castlered

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以用TAKARA的LA 聚合酶，专门用于扩展大片段的，我们以前扩增十几二十kb的都可以
赞一下 回复此楼
10楼2012-07-26 10:04:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yuqin1987 的主题更新
191/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 5/250 2026-09-14 21:36 by vZfe6xYu34yj
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 5/250 2026-09-14 21:33 by vZfe6xYu34yj
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 5/250 2026-09-14 21:25 by vZfe6xYu34yj
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 5/250 2026-09-14 21:24 by vZfe6xYu34yj
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 7/350 2026-09-14 21:21 by vZfe6xYu34yj
[考博] 上海工程技术大学激光智能制造课题组招收博士研究生 +4 两三岁ss 2026-09-14 4/200 2026-09-14 20:29 by 班主任的同桌
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 3/150 2026-09-14 18:01 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 4/200 2026-09-14 17:49 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 4/200 2026-09-14 17:25 by Aj1rhIDL5ixY
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 LwdutQ8HoqWP 2026-09-13 4/200 2026-09-14 16:13 by Aj1rhIDL5ixY
[考研] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 LwdutQ8HoqWP 2026-09-13 4/200 2026-09-14 16:12 by Aj1rhIDL5ixY
[找工作] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 16:00 by Aj1rhIDL5ixY
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:57 by Aj1rhIDL5ixY
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:48 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:37 by Aj1rhIDL5ixY
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +5 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 6/300 2026-09-14 15:21 by Aj1rhIDL5ixY
[基金申请] 求教各位大神：2026教育部人文社科青年基金项目何时公示呀？ +5 云宴山人 2026-09-10 7/350 2026-09-14 12:11 by ecnu2013
[找工作] 浙江师范大学是怎么坑我的 +6 recruit123 2026-09-09 6/300 2026-09-14 12:00 by 萨仁其其格
[考博] 27秋季材料博士申请求助 10+3 Cahal1 2026-09-11 4/200 2026-09-14 08:50 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 面上有专家说实验设备不是我们单位的 +6 zj_muchong 2026-09-08 8/400 2026-09-11 06:56 by suifengdao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭