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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 5kb大片段PCR扩增求助
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yuqin1987

新虫 (初入文坛)

[求助] 5kb大片段PCR扩增求助

我用细菌DNA为模版扩增一5kb片段，用的TAKARA的PrimeSTAR HS DNA Polymerase，反应条件98℃ 5min，98℃ 45s（变性），56℃ 20s（退火），68℃ 5min（延伸），68℃ 8min。扩出来的条带很暗，浓度很低，无法用于后续实验，求助各位高手，多多指教！
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1楼2012-07-23 09:56:38
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2012-07-25 16:29:27
1  使用高纯度的dNTP
2   做梯度试试
3  最后一步延伸时间增加到20min以上。
4  体系选择50 微，稳定性比20微好很多。
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2楼2012-07-24 14:22:51
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+2, 谢谢参与 2012-07-25 16:30:19
我认为可从以下几点改进：
1.加大dNTP量，可加倍
2.72℃延伸6min或7min
3.最后一步延伸10min以上
4.用50微升体系，楼上也说了，一旦扩出来，一管就够后面的实验了
5.还不行的话重新设计引物
我前几天才扩了一个8kb的片段，真难扩呀，且只有一次成功，第二天重复就没出来了，还好有两管成功，希望够后续试验用。
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6楼2012-07-25 06:24:33
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普通回帖

love_st

金虫 (著名写手)
不如重新设计引物
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3楼2012-07-24 16:34:24
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
transgene fastpfu,72度延伸5Min,应该可以搞定
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4楼2012-07-24 22:14:34
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litingwen

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做梯度PCR试验，延伸温度72° 5min试试
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5楼2012-07-24 22:27:55
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我以前扩12kb以上的片段也费了比较大的劲，而且用的都是质粒为模板，前两天我们一个老师用我的质粒为模板，用他自己生产的聚合酶，很轻松的扩增出了18kb，而且只用了20循环，延伸6min。建议使用
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
7楼2012-07-25 11:13:43
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议围绕TM值设计温度梯度PCR，延伸时间可以适当再延长1min。
建议反应条件：
98℃  5min
98℃  45s
温度梯度  20s
72℃  6min
72℃  10min
4℃  ——
25-30个循环。

温度梯度PCR之后选几个结果较好的切胶回收。如果一直都是这样，浓度很低，可以多P几管，回收的时候合在一起应该就够用了。
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8楼2012-07-25 11:22:25
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vir2008

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以试一下同公司的LA Taq，扩增长片段效率会好些。
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9楼2012-07-25 12:59:34
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castlered

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以用TAKARA的LA 聚合酶，专门用于扩展大片段的，我们以前扩增十几二十kb的都可以
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10楼2012-07-26 10:04:07
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