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yuqin1987

新虫 (初入文坛)

[求助] 5kb大片段PCR扩增求助

我用细菌DNA为模版扩增一5kb片段,用的TAKARA的PrimeSTAR HS DNA Polymerase,反应条件98℃ 5min,98℃ 45s(变性),56℃ 20s(退火),68℃ 5min(延伸),68℃ 8min。扩出来的条带很暗,浓度很低,无法用于后续实验,求助各位高手,多多指教!
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议围绕TM值设计温度梯度PCR,延伸时间可以适当再延长1min。
建议反应条件:
98℃  5min
98℃  45s
温度梯度  20s
72℃  6min
72℃  10min
4℃  ——
25-30个循环。

温度梯度PCR之后选几个结果较好的切胶回收。如果一直都是这样,浓度很低,可以多P几管,回收的时候合在一起应该就够用了。
8楼2012-07-25 11:22:25
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