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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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yuqin1987

版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

[求助] 5kb大片段PCR扩增求助

我用细菌DNA为模版扩增一5kb片段,用的TAKARA的PrimeSTAR HS DNA Polymerase,反应条件98℃ 5min,98℃ 45s(变性),56℃ 20s(退火),68℃ 5min(延伸),68℃ 8min。扩出来的条带很暗,浓度很低,无法用于后续实验,求助各位高手,多多指教!
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yixuanwin

实习版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2012-07-25 16:29:27
1  使用高纯度的dNTP
2   做梯度试试
3  最后一步延伸时间增加到20min以上。
4  体系选择50 微,稳定性比20微好很多。
2楼2012-07-24 14:22:51
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stone2239

兑换贵宾

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
silicare: 金币+2, 谢谢参与 2012-07-25 16:30:19
我认为可从以下几点改进:
1.加大dNTP量,可加倍
2.72℃延伸6min或7min
3.最后一步延伸10min以上
4.用50微升体系,楼上也说了,一旦扩出来,一管就够后面的实验了
5.还不行的话重新设计引物
我前几天才扩了一个8kb的片段,真难扩呀,且只有一次成功,第二天重复就没出来了,还好有两管成功,希望够后续试验用。
6楼2012-07-25 06:24:33
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普通回帖

love_st

超级版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!


不如重新设计引物
3楼2012-07-24 16:34:24
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克隆大虾

主管区长

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
transgene fastpfu,72度延伸5Min,应该可以搞定
4楼2012-07-24 22:14:34
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litingwen

管理员

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
做梯度PCR试验,延伸温度72° 5min试试
5楼2012-07-24 22:27:55
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jinpeng_6118

版主

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【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我以前扩12kb以上的片段也费了比较大的劲,而且用的都是质粒为模板,前两天我们一个老师用我的质粒为模板,用他自己生产的聚合酶,很轻松的扩增出了18kb,而且只用了20循环,延伸6min。建议使用
人生百态原为海,看破红尘方为岸!
7楼2012-07-25 11:13:43
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gelois

超级版主

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【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议围绕TM值设计温度梯度PCR,延伸时间可以适当再延长1min。
建议反应条件:
98℃  5min
98℃  45s
温度梯度  20s
72℃  6min
72℃  10min
4℃  ——
25-30个循环。

温度梯度PCR之后选几个结果较好的切胶回收。如果一直都是这样,浓度很低,可以多P几管,回收的时候合在一起应该就够用了。
8楼2012-07-25 11:22:25
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vir2008

兑换贵宾

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【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以试一下同公司的LA Taq,扩增长片段效率会好些。
9楼2012-07-25 12:59:34
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castlered

专家顾问

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【答案】应助回帖

可以用TAKARA的LA 聚合酶,专门用于扩展大片段的,我们以前扩增十几二十kb的都可以
10楼2012-07-26 10:04:07
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