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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 5kb大片段PCR扩增求助
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yuqin1987

新虫 (初入文坛)

[求助] 5kb大片段PCR扩增求助

我用细菌DNA为模版扩增一5kb片段，用的TAKARA的PrimeSTAR HS DNA Polymerase，反应条件98℃ 5min，98℃ 45s（变性），56℃ 20s（退火），68℃ 5min（延伸），68℃ 8min。扩出来的条带很暗，浓度很低，无法用于后续实验，求助各位高手，多多指教！
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1楼2012-07-23 09:56:38
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yuqin1987

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yixuanwin at 2012-07-24 14:22:51
1  使用高纯度的dNTP
2   做梯度试试
3  最后一步延伸时间增加到20min以上。
4  体系选择50 微，稳定性比20微好很多。

dDNP本来就是公司附带的高纯度的
梯度PCR也试过了
都不行。
延伸时间要延长那么多啊？？？
体系也一直都是50ul的
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11楼2012-07-26 15:38:34
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yuqin1987

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by love_st at 2012-07-24 16:34:24
不如重新设计引物

问题是我可以扩的出来，就是浓度不够后续实验啊？
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12楼2012-07-26 15:39:09
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yuqin1987

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by litingwen at 2012-07-24 22:27:55
做梯度PCR试验，延伸温度72° 5min试试

这个试过的，不可以，还是谢谢哦
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13楼2012-07-26 15:41:28
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yuqin1987

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-07-25 11:13:43
我以前扩12kb以上的片段也费了比较大的劲，而且用的都是质粒为模板，前两天我们一个老师用我的质粒为模板，用他自己生产的聚合酶，很轻松的扩增出了18kb，而且只用了20循环，延伸6min。建议使用

他自己生产的聚合酶是什么酶啊？
我现在就怀疑是酶的问题
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14楼2012-07-26 15:43:47
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