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yuqin1987

新虫 (初入文坛)

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专业: 环境生物物理

[求助] 5kb大片段PCR扩增求助

我用细菌DNA为模版扩增一5kb片段，用的TAKARA的PrimeSTAR HS DNA Polymerase，反应条件98℃ 5min，98℃ 45s（变性），56℃ 20s（退火），68℃ 5min（延伸），68℃ 8min。扩出来的条带很暗，浓度很低，无法用于后续实验，求助各位高手，多多指教！

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1楼2012-07-23 09:56:38

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yuqin1987

新虫 (初入文坛)

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专业: 环境生物物理

引用回帖:

3楼: Originally posted by love_st at 2012-07-24 16:34:24
不如重新设计引物

问题是我可以扩的出来，就是浓度不够后续实验啊？

12楼2012-07-26 15:39:09

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查看全部 19 个回答

yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2012-07-25 16:29:27

1  使用高纯度的dNTP
2 做梯度试试
3  最后一步延伸时间增加到20min以上。
4  体系选择50 微，稳定性比20微好很多。

赞一下(1人)

2楼2012-07-24 14:22:51

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love_st

金虫 (著名写手)

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不如重新设计引物

3楼2012-07-24 16:34:24

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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

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专业: 微生物生理与生物化学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

transgene fastpfu,72度延伸5Min,应该可以搞定

4楼2012-07-24 22:14:34

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