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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 5kb大片段PCR扩增求助
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yuqin1987

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yixuanwin at 2012-07-24 14:22:51
1  使用高纯度的dNTP
2   做梯度试试
3  最后一步延伸时间增加到20min以上。
4  体系选择50 微，稳定性比20微好很多。

dDNP本来就是公司附带的高纯度的
梯度PCR也试过了
都不行。
延伸时间要延长那么多啊？？？
体系也一直都是50ul的
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11楼2012-07-26 15:38:34
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yuqin1987

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by love_st at 2012-07-24 16:34:24
不如重新设计引物

问题是我可以扩的出来，就是浓度不够后续实验啊？
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12楼2012-07-26 15:39:09
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yuqin1987

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by litingwen at 2012-07-24 22:27:55
做梯度PCR试验，延伸温度72° 5min试试

这个试过的，不可以，还是谢谢哦
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13楼2012-07-26 15:41:28
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yuqin1987

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-07-25 11:13:43
我以前扩12kb以上的片段也费了比较大的劲，而且用的都是质粒为模板，前两天我们一个老师用我的质粒为模板，用他自己生产的聚合酶，很轻松的扩增出了18kb，而且只用了20循环，延伸6min。建议使用

他自己生产的聚合酶是什么酶啊？
我现在就怀疑是酶的问题
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14楼2012-07-26 15:43:47
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love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by yuqin1987 at 2012-07-26 15:39:09
问题是我可以扩的出来，就是浓度不够后续实验啊？...

说明扩增效率不够，竞争不过错配呗
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15楼2012-07-26 16:05:09
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by yuqin1987 at 2012-07-26 15:38:34
dDNP本来就是公司附带的高纯度的
梯度PCR也试过了
都不行。
延伸时间要延长那么多啊？？？
体系也一直都是50ul的...

产物浓度不够 就加循环。或者 做多管，富集到一管回收。  方法还是很多的
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16楼2012-07-27 12:36:36
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by yuqin1987 at 2012-07-26 15:43:47
他自己生产的聚合酶是什么酶啊？
我现在就怀疑是酶的问题...

应该是聚合酶的能力问题吧
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
17楼2012-07-27 14:41:30
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muchong5577

金虫 (正式写手)
还是换一个酶吧。这么长的片段，用好酶才能扩，而且保真性好才行。
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18楼2012-07-27 15:24:15
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by stone2239 at 2012-07-25 06:24:33
我认为可从以下几点改进：
1.加大dNTP量，可加倍
2.72℃延伸6min或7min
3.最后一步延伸10min以上
4.用50微升体系，楼上也说了，一旦扩出来，一管就够后面的实验了
5.还不行的话重新设计引物
我前几天才扩了一 ...

8K，楼主都是扩大片段的么，用的是什么酶啊？
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TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
19楼2013-09-09 21:43:17
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