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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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yuqin1987

超级版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

[求助] 5kb大片段PCR扩增求助

我用细菌DNA为模版扩增一5kb片段,用的TAKARA的PrimeSTAR HS DNA Polymerase,反应条件98℃ 5min,98℃ 45s(变性),56℃ 20s(退火),68℃ 5min(延伸),68℃ 8min。扩出来的条带很暗,浓度很低,无法用于后续实验,求助各位高手,多多指教!
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yixuanwin

兑换贵宾

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【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by yuqin1987 at 2012-07-26 15:38:34
dDNP本来就是公司附带的高纯度的
梯度PCR也试过了
都不行。
延伸时间要延长那么多啊???
体系也一直都是50ul的...

产物浓度不够 就加循环。或者 做多管,富集到一管回收。  方法还是很多的
16楼2012-07-27 12:36:36
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yixuanwin

超级版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2012-07-25 16:29:27
1  使用高纯度的dNTP
2   做梯度试试
3  最后一步延伸时间增加到20min以上。
4  体系选择50 微,稳定性比20微好很多。
2楼2012-07-24 14:22:51
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love_st

专家顾问

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!


不如重新设计引物
3楼2012-07-24 16:34:24
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克隆大虾

兑换贵宾

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
transgene fastpfu,72度延伸5Min,应该可以搞定
4楼2012-07-24 22:14:34
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