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nogojin

新虫 (小有名气)

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我想PCR技术你应该没有问题。最重要的一步，是把质粒线性化。用一个载体上的酶切去PCR，做克隆，模板不要太多，20ng的模板，20-22个循环数足矣。对于大片段，可以用俩温度PCR。成功后告诉我一下。

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11楼2013-08-06 20:56:10

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cfr1990

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

做梯度试试
最后一步延伸时间增加到20min以上。
体系选择50 微，稳定性比20微好很多。

我认为可从以下几点改进：
1.加大dNTP量，可加倍
2.72℃延伸6min或7min
3.最后一步延伸10min以上
4.用50微升体系，楼上也说了，一旦扩出来，一管就够后面的实验了
5.还不行的话重新设计引物
我前几天才扩了一个8kb的片段，真难扩呀，且只有一次成功，第二天重复就没出来了，还好有两管成功，希望够后续试验用。

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12楼2013-08-23 14:03:31

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木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

因为是用质粒做模板，为了避免扩增整个质粒，质粒可以先酶切开，或者延伸时间宁可略少于计算出来的时间也不要多（可以改在最后25-30个循环时延长延伸时间），而且模板的量减少50-100倍，可以减少加入扩增体系的抑制因子，也是为了避免扩增整个质粒。循环次数在20-35个。可以试试用Takara的PRIMERSTAR GXL。先考虑增加Mg2+浓度，再考虑增加dNTP。如果GC含量高，使用GC buffer。

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为什么

13楼2013-08-24 08:04:36

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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

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【答案】应助回帖

长片段PC不同于一般PCR的特殊要求：
1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了2020kd,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物（25-30 bp)。

我今天的回答比过去的同类问题的回答要简便，应该更容易操作一些。

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14楼2014-07-08 01:58:43

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