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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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nogojin

新虫 (小有名气)

我想PCR技术你应该没有问题。最重要的一步,是把质粒线性化。用一个载体上的酶切去PCR,做克隆,模板不要太多,20ng的模板,20-22个循环数足矣。对于大片段,可以用俩温度PCR。成功后告诉我一下。
11楼2013-08-06 20:56:10
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cfr1990

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

做梯度试试
最后一步延伸时间增加到20min以上。
体系选择50 微,稳定性比20微好很多。

我认为可从以下几点改进:
1.加大dNTP量,可加倍
2.72℃延伸6min或7min
3.最后一步延伸10min以上
4.用50微升体系,楼上也说了,一旦扩出来,一管就够后面的实验了
5.还不行的话重新设计引物
我前几天才扩了一个8kb的片段,真难扩呀,且只有一次成功,第二天重复就没出来了,还好有两管成功,希望够后续试验用。
12楼2013-08-23 14:03:31
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

因为是用质粒做模板,为了避免扩增整个质粒,质粒可以先酶切开,或者延伸时间宁可略少于计算出来的时间也不要多(可以改在最后25-30个循环时延长延伸时间),而且模板的量减少50-100倍,可以减少加入扩增体系的抑制因子,也是为了避免扩增整个质粒。循环次数在20-35个。可以试试用Takara的PRIMERSTAR GXL。先考虑增加Mg2+浓度,再考虑增加dNTP。如果GC含量高,使用GC buffer。
为什么
13楼2013-08-24 08:04:36
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

长片段PC不同于一般PCR的特殊要求:
1.用Taq-LA DNA聚合酶,该酶是Taq酶或Klentaq 1(无纠错功能)与pfu酶或Deep Vent酶(有纠错功能)的混合物,以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kd时,需要加入高浓度的甜茶碱(终浓度为1.5-2.0mol/L),提高PCR的效率,但是甜茶碱加入后,要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了2020kd,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度,不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短,尤其是一般不超过30 s,尤其是模板长度超过8KD时更是如此,变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度,同时加长延伸反应时间,长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟,长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟,楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为:500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵,25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物(25-30 bp)。

我今天的回答比过去的同类问题的回答要简便,应该更容易操作一些。
14楼2014-07-08 01:58:43
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

更正:上贴的标题应为;“长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求”。
15楼2014-07-08 02:03:43
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

这个不难啊,我就扩过7k的,很轻松,留下QQ聊。

[ 发自小木虫客户端 ]
16楼2014-07-08 10:56:36
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titus0805

铁虫 (小有名气)

测序用的什么引物啊。测序都能测出来,pcr也应该没问题。
17楼2014-12-31 08:21:48
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匿名

用户注销 (小有名气)

本帖仅楼主可见
18楼2015-05-12 10:35:08
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