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lhl2225

金虫 (正式写手)

应助: 0 (幼儿园)
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注册: 2007-04-09
性别: GG
专业: 细胞信号转导

[求助] 求长片段（7.5 kb）PCR扩增方法？已有2人参与

目前手头有个工作，需要克隆一个基因的全长。
模板已经过测序，是没有问题的。

遇到问题：
1. 两端设计引物，试了LA taq，KOD，Taq等P不出来。
2.中间设计引物分段P，也P不出来。
3.直接在中间设计两条引物，随便P一段也P不出来。

急！！！

求高人指点！如果根据您的建议P出来了，将赠送100金币酬谢。

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我想做到的一定能成功！自信不是简单地渴望别人认可你，你要在内心深处觉得，我可以。这样就不用理会别人的怀疑或轻视。

1楼 2013-08-01 17:31:38

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木虫 (著名写手)

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专业: 系统生物学

【答案】应助回帖

因为是用质粒做模板，为了避免扩增整个质粒，质粒可以先酶切开，或者延伸时间宁可略少于计算出来的时间也不要多（可以改在最后25-30个循环时延长延伸时间），而且模板的量减少50-100倍，可以减少加入扩增体系的抑制因子，也是为了避免扩增整个质粒。循环次数在20-35个。可以试试用Takara的PRIMERSTAR GXL。先考虑增加Mg2+浓度，再考虑增加dNTP。如果GC含量高，使用GC buffer。