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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段PCR(2.1K)扩增求助
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dfhfzyl

铁虫 (小有名气)

[求助] 大片段PCR(2.1K)扩增求助

我要扩增一个片段为2100bp的cDNA
我的目的基因是来自柑橘的基因,柑橘基因组已经发布了. 设计引物时,直接选基因cds全长的头尾14-22bp, 正反引物的GC比例尽量保持一致了.
我的扩增条件是:
模板2ul (模板浓度约为500ng)
正反引物为0.2ul
buffer 2ul
dNTP 2ul
Mgcl2 1.2ul
Taq酶 0.2 (我师兄建议我在真正扩增时需选择高保真酶如pfu)
ddH2O2调到20ul体系
PCR条件
94度4min
94度30秒
55度30秒
72度2:10分
30个循环
72度10分
4度半小时
按照以上的程序,我对6个目的基因(大小在都在2kB左右)扩增了好几次都没有明显的带出来或者带很弱,而有一个基因出现了三条非常弱的带? 求助高手!!!
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1楼2012-04-25 10:09:45
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回帖置顶 ( 共有1个 )

to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-04-25 13:56:50
1949stone: MolEPI+1 2012-05-03 07:27:34
1.这么大的cDNA确实不好扩，楼主首先要保证模板的质量，这是先决条件。
2.如果模板没问题可以考虑两步法扩增尝试，对扩大片段也许会好些。
3.实在拿不到全长就分开扩，一段一段的再连接起来。
4.比较下基因组和cDNA，没有内含子的地方就直接用基因组当模板好了。
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生活是面镜子~
2楼2012-04-25 13:20:37
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普通回帖

喧嚣的尘埃

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励新虫积极参与！ 2012-04-26 21:48:42
确保模板质量和纯度，我个人觉得你的引物添加量可以适当的提高一点。比如0.5微升。
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相信自己所相信的
3楼2012-04-26 17:22:10
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ixido

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-26 21:48:55
前几个人说的都很重要，就不在赘述了。
建议楼主换好一点的酶，如pfu。然后把延伸时间加长，同时把复性温度进行优化。此外，楼主需要看一看设计的引物是不是和模版其他位置有重叠。
还有，国内的聚合酶质量没有想象中的那么好，适当的多加一点没事的，摸摸条件，摸好了做个大的就行了。
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4楼2012-04-26 18:27:19
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, 专家考核, 天使君做这个很牛滴 2012-04-26 21:49:13
1.体系有点问题，为何20ul体系要加这么多模板和dNTP呢？并不是加的多就可以扩增出来的；
2.条带不亮或许和退火温度有关系呢。。。
3.延伸时间可以放至2:30
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2012-04-26 18:49:28
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dfhfzyl

铁虫 (小有名气)
嗯　正在不断的摸过条件呢　希望能够扩增出来
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6楼2012-05-01 14:20:33
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whj3344

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以试一下takara的DNA聚合酶，里面有针对长片段PCR的，效果还是不错，曾经做过10kb的
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7楼2012-05-01 15:19:18
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vinie

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 同意 2012-05-03 07:28:26
PrimerSTAR takara的，扩增长片段还是不错的，还有，可以减少模板量
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8楼2012-05-01 20:18:31
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dfhfzyl

铁虫 (小有名气)
很奇怪，我用普通TAQ能够扩增出很不错的带，但是用pfu，ex-taq或者前二者与taq酶混合都扩不出来．　大家有没有碰到这种问题呢？
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9楼2012-05-02 20:25:03
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vir2008

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+2, 支持下　有时候也要看选择的区域 2012-05-03 07:28:57
引用回帖:
9楼: Originally posted by dfhfzyl at 2012-05-02 20:25:03:
很奇怪，我用普通TAQ能够扩增出很不错的带，但是用pfu，ex-taq或者前二者与taq酶混合都扩不出来．　大家有没有碰到这种问题呢？

保真度高的酶要校正，效率低，所以产物自然就少了。混合的酶，所需的体系各不相同，也可能彼此影响效果。
2kb左右的话，还是建议考虑PrimeStar之类的酶。没必要再用普通Taq尝试，因为这样扩出的产物也未必能用。GC含量太高的话，可以用GC buffer，不过保真度会下降。
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10楼2012-05-02 23:42:33
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