应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段PCR(2.1K)扩增求助
51/1返回列表
查看: 4584  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

dfhfzyl

铁虫 (小有名气)

[求助] 大片段PCR(2.1K)扩增求助

我要扩增一个片段为2100bp的cDNA
我的目的基因是来自柑橘的基因,柑橘基因组已经发布了. 设计引物时,直接选基因cds全长的头尾14-22bp, 正反引物的GC比例尽量保持一致了.
我的扩增条件是:
模板2ul (模板浓度约为500ng)
正反引物为0.2ul
buffer 2ul
dNTP 2ul
Mgcl2 1.2ul
Taq酶 0.2 (我师兄建议我在真正扩增时需选择高保真酶如pfu)
ddH2O2调到20ul体系
PCR条件
94度4min
94度30秒
55度30秒
72度2:10分
30个循环
72度10分
4度半小时
按照以上的程序,我对6个目的基因(大小在都在2kB左右)扩增了好几次都没有明显的带出来或者带很弱,而有一个基因出现了三条非常弱的带? 求助高手!!!
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验 【分子生物】EPI帖 代谢毒理细胞生物

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-04-25 10:09:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ixido

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-26 21:48:55
前几个人说的都很重要，就不在赘述了。
建议楼主换好一点的酶，如pfu。然后把延伸时间加长，同时把复性温度进行优化。此外，楼主需要看一看设计的引物是不是和模版其他位置有重叠。
还有，国内的聚合酶质量没有想象中的那么好，适当的多加一点没事的，摸摸条件，摸好了做个大的就行了。
赞一下 回复此楼
4楼2012-04-26 18:27:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-04-25 13:56:50
1949stone: MolEPI+1 2012-05-03 07:27:34
1.这么大的cDNA确实不好扩，楼主首先要保证模板的质量，这是先决条件。
2.如果模板没问题可以考虑两步法扩增尝试，对扩大片段也许会好些。
3.实在拿不到全长就分开扩，一段一段的再连接起来。
4.比较下基因组和cDNA，没有内含子的地方就直接用基因组当模板好了。
赞一下(2人) 回复此楼
生活是面镜子~
2楼2012-04-25 13:20:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

喧嚣的尘埃

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励新虫积极参与！ 2012-04-26 21:48:42
确保模板质量和纯度，我个人觉得你的引物添加量可以适当的提高一点。比如0.5微升。
赞一下 回复此楼
相信自己所相信的
3楼2012-04-26 17:22:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, 专家考核, 天使君做这个很牛滴 2012-04-26 21:49:13
1.体系有点问题，为何20ul体系要加这么多模板和dNTP呢？并不是加的多就可以扩增出来的；
2.条带不亮或许和退火温度有关系呢。。。
3.延伸时间可以放至2:30
赞一下 回复此楼
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2012-04-26 18:49:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[有机交流] OpenAI又攻克数学难题了，离AI做有机合成还有多远？ +8 wangyl_123 2026-10-10 12/600 2026-10-13 20:40 by Merryya
[硕博家园] 极限拉扯，如何抉择 +9 Isak0320 2026-10-12 13/650 2026-10-13 11:57 by Isak0320
[教师之家] 课题组会帮你通过考核么？ +4 好运来～9527 2026-10-10 7/350 2026-10-13 08:41 by xli1984
[基金申请] 入职后第一次管课题组的专利缴费，对账才发现官费比别人多掏了一倍 +6 13108017953 2026-10-08 6/300 2026-10-12 20:07 by w3w3y3
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:34 by XQNyDCa1Tk5n
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 22:26 by XQNyDCa1Tk5n
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:26 by XQNyDCa1Tk5n
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:15 by XQNyDCa1Tk5n
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 22:11 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:06 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 14:25 by VOMexwnDzOFZ
[教师之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 (EPI+-1)(金币-50) +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 14:05 by VOMexwnDzOFZ
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:51 by VOMexwnDzOFZ
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:45 by VOMexwnDzOFZ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 10:54 by VOMexwnDzOFZ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 10:34 by VOMexwnDzOFZ
[考博] 招收博士生一名 +3 mandolin 2026-10-10 3/150 2026-10-11 10:21 by 不是山谷！
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 4/200 2026-10-11 03:14 by M0zrYVSAnxpE
[有机交流] 各位大佬，路线设计求助 +6 zapen 2026-10-08 8/400 2026-10-10 15:59 by zapen
[有机交流] 我应该选哪条合成路线让实验成功率高一些？ +5 jing816y 2026-10-08 9/450 2026-10-10 09:05 by zapen
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭