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dfhfzyl铁虫 (小有名气)
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[求助]
大片段PCR(2.1K)扩增求助
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我要扩增一个片段为2100bp的cDNA 我的目的基因是来自柑橘的基因,柑橘基因组已经发布了. 设计引物时,直接选基因cds全长的头尾14-22bp, 正反引物的GC比例尽量保持一致了. 我的扩增条件是: 模板2ul (模板浓度约为500ng) 正反引物为0.2ul buffer 2ul dNTP 2ul Mgcl2 1.2ul Taq酶 0.2 (我师兄建议我在真正扩增时需选择高保真酶如pfu) ddH2O2调到20ul体系 PCR条件 94度4min 94度30秒 55度30秒 72度2:10分 30个循环 72度10分 4度半小时 按照以上的程序,我对6个目的基因(大小在都在2kB左右)扩增了好几次都没有明显的带出来或者带很弱,而有一个基因出现了三条非常弱的带? 求助高手!!! |
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