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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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annwt

木虫 (正式写手)

2.1kbd DNA模板很容易。
如果是cDNA经验估计是模板问题。
实在不行先分段扩吧,虽说是下策但是有效。
11楼2013-11-24 21:23:42
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

实在不行用长片段,不过长片段PCR一般用于3KD以上,你这个也可以试用。

长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求:
1.用Taq-LA DNA聚合酶,该酶是Taq酶或Klentaq 1(无纠错功能)与pfu酶或Deep Vent酶(有纠错功能)的混合物,以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kd时,需要加入高浓度的甜茶碱(终浓度为1.5-2.0mol/L),提高PCR的效率,但是甜茶碱加入后,要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了2020kd,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度,不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短,尤其是一般不超过30 s,尤其是模板长度超过8KD时更是如此,变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度,同时加长延伸反应时间,长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟,长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟,楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为:500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵,25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物(25-30 bp)。

我今天的回答比过去的同类问题的回答要简便,应该更容易操作一些。
12楼2014-07-08 02:00:54
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Neo2000

木虫 (著名写手)

不是我想吐你的槽,2k就不要拿来说事啦,引物设计好了,随便一个mix就拿下了。

[ 发自小木虫客户端 ]
13楼2014-07-08 12:33:52
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