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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段PCR(2.1K)扩增求助
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annwt

木虫 (正式写手)
2.1kbd DNA模板很容易。
如果是cDNA经验估计是模板问题。
实在不行先分段扩吧，虽说是下策但是有效。
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11楼2013-11-24 21:23:42
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
实在不行用长片段，不过长片段PCR一般用于3KD以上，你这个也可以试用。

长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求：
1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了2020kd,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物（25-30 bp)。

我今天的回答比过去的同类问题的回答要简便，应该更容易操作一些。
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12楼2014-07-08 02:00:54
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Neo2000

木虫 (著名写手)
不是我想吐你的槽，2k就不要拿来说事啦，引物设计好了，随便一个mix就拿下了。

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13楼2014-07-08 12:33:52
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