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dfhfzyl铁虫 (小有名气)
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[求助]
大片段PCR(2.1K)扩增求助
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我要扩增一个片段为2100bp的cDNA 我的目的基因是来自柑橘的基因,柑橘基因组已经发布了. 设计引物时,直接选基因cds全长的头尾14-22bp, 正反引物的GC比例尽量保持一致了. 我的扩增条件是: 模板2ul (模板浓度约为500ng) 正反引物为0.2ul buffer 2ul dNTP 2ul Mgcl2 1.2ul Taq酶 0.2 (我师兄建议我在真正扩增时需选择高保真酶如pfu) ddH2O2调到20ul体系 PCR条件 94度4min 94度30秒 55度30秒 72度2:10分 30个循环 72度10分 4度半小时 按照以上的程序,我对6个目的基因(大小在都在2kB左右)扩增了好几次都没有明显的带出来或者带很弱,而有一个基因出现了三条非常弱的带? 求助高手!!! |
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凌波丽
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实在不行用长片段，不过长片段PCR一般用于3KD以上，你这个也可以试用。 长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求： 1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。 2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了2020kd,甜茶碱可以少加点。 3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。 4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。 5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。 6.模板浓度最好在1ng/L以内。 7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。 8.设计较长的PCR引物（25-30 bp)。 我今天的回答比过去的同类问题的回答要简便，应该更容易操作一些。 |
12楼2014-07-08 02:00:54
2楼2012-04-25 13:20:37
3楼2012-04-26 17:22:10
ixido
木虫 (小有名气)
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- 专业: 生物化学
4楼2012-04-26 18:27:19