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lilirong2009

铜虫 (小有名气)

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[求助] 短片段PCR扩增

我最近在扩增三个目的条带，长度分别是65,144和236bp。我用的25微升体系，镁离子的终浓度是2.5mM，酶是1.25u，引物的Tm均为55℃。PCR条件为：
（1）95℃ 3min
（2）95℃ 30s
（3）60-50 ℃ （gradient 10℃）40s
（4）72℃ 45s
（5）（2）-（4）39
（6）72℃ 10min
（7）4℃ forever
用上面的变化退火条件下65bp和144bp的目的条带均扩增出来，且每个温度都可扩增出来条带，但是量不大，电泳条带较暗。236bp的条带在8个变化温度下均未扩增出来。今天下午针对236bp的目的条带，我把dNTP、模板和酶都增加0.2微升，PCR条件中退火温度变为60-45℃ （gradient 15℃）45s，延伸时间变为50s，结果如图中的a-j条带，但是也出现了非特异性条带，只有退火温度为57.5℃的未出现非特异性，但是条带很淡。我在这个PCR条件下同时还做了64bp和144bp的样（但体系加样量不变），结果如图中1-6条带，条带还是暗淡。针对此实验，有两问题忘高人帮忙：
（1）对于236bp目的条带的扩增如何改动以减少非特异性条带
（2）对于3个目的条带如何增加产量

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1楼2012-08-25 22:40:25

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reallpf

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极解答问题 2012-08-27 13:33:10

对于特异性，你的pcr结果已经不错了，个人不建议你为了增加特异性而再增加退火温度；pcr的循环数一般20--35个循环足矣，到后期你里面的dNTP也都没有了，都是无效循环。所以建议你减少循环数；同时也建议你减少退火时间到25s或30s。
对于产量，有几个建议：
增加PCR平行数，以量增加最后产量；将你的pcr产物稀释100--200倍后作为模板再进行pcr；利用touch down PCR，一定程度可以增加。
对于pcr，建议不要加太多酶，不出条带应该继续降低退火温度。一般pcr的退火温度比算出来的Tm值少5--10度。
以上仅为个人建议。