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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 短片段PCR扩增
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lilirong2009

铜虫 (小有名气)

[求助] 短片段PCR扩增

我最近在扩增三个目的条带，长度分别是65,144和236bp。我用的25微升体系，镁离子的终浓度是2.5mM，酶是1.25u，引物的Tm均为55℃。PCR条件为：
（1）95℃ 3min
（2）95℃ 30s
（3）60-50 ℃ （gradient 10℃）40s
（4）72℃ 45s
（5）（2）-（4）39
（6）72℃ 10min
（7）4℃ forever
用上面的变化退火条件下65bp和144bp的目的条带均扩增出来，且每个温度都可扩增出来条带，但是量不大，电泳条带较暗。236bp的条带在8个变化温度下均未扩增出来。今天下午针对236bp的目的条带，我把dNTP、模板和酶都增加0.2微升，PCR条件中退火温度变为60-45℃ （gradient 15℃）45s，延伸时间变为50s，结果如图中的a-j条带，但是也出现了非特异性条带，只有退火温度为57.5℃的未出现非特异性，但是条带很淡。我在这个PCR条件下同时还做了64bp和144bp的样（但体系加样量不变），结果如图中1-6条带，条带还是暗淡。针对此实验，有两问题忘高人帮忙：
（1）对于236bp目的条带的扩增如何改动以减少非特异性条带
（2）对于3个目的条带如何增加产量
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1楼2012-08-25 22:40:25
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huangguoqing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-27 13:32:47
增加模板和引物的量会增加产物的量，但产物的特异性会降低。你那两个短片段的可以适当增加点模板或者引物的量，236bp的可以增加点退火温度试试。再有，问一个问题，你是做RT-PCR么？
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3楼2012-08-27 10:50:10
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