应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 欲PCR扩增4200bp左右的目的片段，一直得不到目的条带，求高人指教！
261/3返回列表123下一页
查看: 4424  |  回复: 25
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

卓尔不凡2012

银虫 (正式写手)

[求助] 欲PCR扩增4200bp左右的目的片段，一直得不到目的条带，求高人指教！已有2人参与

本人欲PCR扩增一4200bp左右的目的基因片段，用过TaKaRa的LA酶、HS Taq酶，用过全式金的FastPfu Fly DNA Polymerase均无目的条带，很是郁闷，跑电泳时用0.5%的胶，100V跑25min，但加样孔处一直有很亮的一团，请高手指点，我怎样才能扩增出目的条带？？
欲PCR扩增4200bp左右的目的片段，一直得不到目的条带，求高人指教！
小木虫.jpg

[ Last edited by 卓尔不凡2012 on 2013-6-22 at 20:02 ]
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2013-06-22 20:00:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 回帖置顶 2013-06-24 07:51:46
1949stone: 金币+1, 同意 2013-06-24 07:51:54
卓尔不凡2012: 金币+1, ★有帮助 2013-06-24 15:43:02
既然你换了好几种酶，都没有达到你的目的，看来问题不是出在酶上面了！
你要考虑一下，你的引物，模板本身是不是合理，还有你的反应体系是不是正确了！
赞一下 回复此楼
9楼2013-06-23 17:12:03
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

137167741

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
卓尔不凡2012: 金币+1 2013-06-24 15:43:31
引用回帖:
3楼: Originally posted by 卓尔不凡2012 at 2013-06-22 21:40:01
20微升的体系，模板用了2.5微升，我是按照TaKaRa的LA Taq说明书加的。...

模板加多少，不是看体积，而是取决于模版的浓度，PCR反应，模板浓度不能过高~~~
赞一下(1人) 回复此楼
总有一天我要修改用户名。
7楼2013-06-23 14:27:11
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

CR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下：一．引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。对策：重新设计引物。二．Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度。三．靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。这种非特异性带出现可用以下方法解决：（1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。（2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。（3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。（4）重新提取模板DNA。2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。

相关的问题，我过去回答过，但是这次的回答做了补充和修改。最近我重要回答PCR的问题，还好，我自己正好近几日重写了一些实验操作总结，其中就有不止一篇有关PCR的，看那个问题符合我写的就直接粘帖上来，下周开始再接着总结一些，这周我是不写了。
赞一下(1人) 回复此楼
17楼2013-07-19 23:26:11
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-21 07:55:20
首先，你需要查下你的酶是否适合4kbp的片断pcr
再者，你可以调整你的反应体系，量的方面和正常的pcr没有区别，但是在小的方面，反应条件的设定要根据你的片断大小调整各个反应阶段的时间——变性、延伸等，通常第一次会很淡，你再优化一下就可以了
赞一下(1人) 回复此楼
修身、齐家、治国、平天下
22楼2013-07-20 18:45:45
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三撇五撇

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-21 07:55:26
首先 检查引物设计是否合理，其次检查模板浓度不要太高。
再次试下以下方案：第一步95度 3min30s
                           第二步98    15s
                           第三步68    4min   
                           第四步 72    10

                             2~3循环24次
赞一下(1人) 回复此楼
23楼2013-07-20 21:20:57
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

这东西在一个探索上，慢慢地排除：taq酶应该没问题。会不会是模版质量不好，或者模版浓度太高；会不会是引物设计问题，退火温度不合理。。。
赞一下(1人) 回复此楼
我不会！
24楼2014-06-25 16:30:37
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

overhalfmoon

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
卓尔不凡2012(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-23 12:34:06
卓尔不凡2012: 金币+1 2013-06-24 15:43:10
试试少一点模板，或者稀释你的模板。先稀释20-50倍试试
赞一下 回复此楼
2楼2013-06-22 21:25:52
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

卓尔不凡2012

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by overhalfmoon at 2013-06-22 21:25:52
试试少一点模板，或者稀释你的模板。先稀释20-50倍试试

20微升的体系，模板用了2.5微升，我是按照TaKaRa的LA Taq说明书加的。
赞一下 回复此楼
3楼2013-06-22 21:40:01
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-23 12:34:17
你的模板定浓度了吗？PCR能看到模板说明模板用量太大了。
赞一下 回复此楼
4楼2013-06-23 01:34:35
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
卓尔不凡2012(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-23 12:35:02
减少模板用量
添加适量镁离子（用量参考相应说明书）
赞一下 回复此楼
5楼2013-06-23 10:44:30
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qiuqu_200212

至尊木虫 (知名作家)

无助又无奈

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 同意 2013-06-24 07:51:32
卓尔不凡2012: 金币+1 2013-06-24 15:43:25
模版尽量是25微升体系，1微升也较多了。
还有就是尽量用酶活性大的公司酶。宝生物的酶活性是较低的品种。
赞一下 回复此楼
无奈又无助的天鹅，孤零零
6楼2013-06-23 12:57:28
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冰风颤木

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
卓尔不凡2012: 金币+1 2013-06-24 15:43:36
推荐楼主你使用高保真的酶试试吧 去宝生物公司网站看看 我最近也在扩增大片段啊。。。
赞一下 回复此楼
船到桥头自然直
8楼2013-06-23 15:45:23
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 引物是重点 2013-06-24 07:52:15
卓尔不凡2012: 金币+1 2013-06-24 15:43:42
用扩增好的产物做模板再试试。感觉是引物设计的不好，一般来说，4k还是能扩增的。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
10楼2013-06-23 19:25:08
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 卓尔不凡2012 的主题更新
261/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭