应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 欲PCR扩增4200bp左右的目的片段，一直得不到目的条带，求高人指教！
263/3返回列表上一页123
查看: 4930  |  回复: 25
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

小白虾

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感觉模板浓度高了，还有就是引物设计的不太好，可考虑一下重新设计引物
赞一下 回复此楼
飞的更高
21楼2013-07-20 15:32:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-21 07:55:20
首先，你需要查下你的酶是否适合4kbp的片断pcr
再者，你可以调整你的反应体系，量的方面和正常的pcr没有区别，但是在小的方面，反应条件的设定要根据你的片断大小调整各个反应阶段的时间——变性、延伸等，通常第一次会很淡，你再优化一下就可以了
赞一下(1人) 回复此楼
修身、齐家、治国、平天下
22楼2013-07-20 18:45:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三撇五撇

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-21 07:55:26
首先 检查引物设计是否合理，其次检查模板浓度不要太高。
再次试下以下方案：第一步95度 3min30s
                           第二步98    15s
                           第三步68    4min   
                           第四步 72    10

                             2~3循环24次
赞一下(1人) 回复此楼
23楼2013-07-20 21:20:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

这东西在一个探索上，慢慢地排除：taq酶应该没问题。会不会是模版质量不好，或者模版浓度太高；会不会是引物设计问题，退火温度不合理。。。
赞一下(1人) 回复此楼
我不会！
24楼2014-06-25 16:30:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

楼主可以改用长片段PCR扩增体系。

长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求

                                凌波丽

                               2014-7-11

3kb-20kb的DNA片段适用长片段PCR扩增。
1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kb时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了20kb,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KB时更是如此，变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kb的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kb的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物（25-30 bp)
其他同同普通PCR。

参考一下。
赞一下 回复此楼
25楼2014-08-24 14:43:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

陈曦0704

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 卓尔不凡2012 at 2013-06-22 20:00:51
本人欲PCR扩增一4200bp左右的目的基因片段，用过TaKaRa的LA酶、HS Taq酶，用过全式金的FastPfu Fly DNA Polymerase均无目的条带，很是郁闷，跑电泳时用0.5%的胶，100V跑25min，但加样孔处一直有很亮的一团:swe ...

请问楼主最后做出来了吗，是什么原因扩不出来呢

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
26楼2017-12-03 21:52:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 卓尔不凡2012 的主题更新
263/3返回列表上一页123
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +16 Ldrop2023 2026-08-13 20/1000 2026-08-20 11:07 by xskun
[基金申请] 言之凿凿，8月21号(明天)放榜 +12 医学老男孩 2026-08-20 14/700 2026-08-20 10:53 by ran2233
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +13 基诺咪客 2026-08-17 17/850 2026-08-20 10:43 by wangyue2015
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +55 医学老男孩 2026-08-13 125/6250 2026-08-20 09:02 by 医学老男孩
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +14 kkkl_v 2026-08-19 15/750 2026-08-20 08:21 by sunzitan
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +11 ziyangfang 2026-08-19 13/650 2026-08-19 21:28 by aasahr
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +4 yuleib84 2026-08-19 5/250 2026-08-19 19:52 by hhs666
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +10 wangze12014 2026-08-14 12/600 2026-08-19 16:56 by 苦难博士
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-19 09:56 by ZJTJZ
[基金申请] 什么时候开奖？ +6 CrisMessi 2026-08-18 6/300 2026-08-19 08:06 by Equinoxhua
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +14 archvillain 2026-08-15 26/1300 2026-08-18 13:37 by phantomgost
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭