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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 欲PCR扩增4200bp左右的目的片段，一直得不到目的条带，求高人指教！
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小白虾

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感觉模板浓度高了，还有就是引物设计的不太好，可考虑一下重新设计引物
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飞的更高
21楼2013-07-20 15:32:42
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-21 07:55:20
首先，你需要查下你的酶是否适合4kbp的片断pcr
再者，你可以调整你的反应体系，量的方面和正常的pcr没有区别，但是在小的方面，反应条件的设定要根据你的片断大小调整各个反应阶段的时间——变性、延伸等，通常第一次会很淡，你再优化一下就可以了
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修身、齐家、治国、平天下
22楼2013-07-20 18:45:45
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三撇五撇

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-21 07:55:26
首先 检查引物设计是否合理，其次检查模板浓度不要太高。
再次试下以下方案：第一步95度 3min30s
                           第二步98    15s
                           第三步68    4min   
                           第四步 72    10

                             2~3循环24次
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23楼2013-07-20 21:20:57
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三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

这东西在一个探索上，慢慢地排除：taq酶应该没问题。会不会是模版质量不好，或者模版浓度太高；会不会是引物设计问题，退火温度不合理。。。
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我不会！
24楼2014-06-25 16:30:37
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

楼主可以改用长片段PCR扩增体系。

长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求

                                凌波丽

                               2014-7-11

3kb-20kb的DNA片段适用长片段PCR扩增。
1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kb时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了20kb,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KB时更是如此，变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kb的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kb的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物（25-30 bp)
其他同同普通PCR。

参考一下。
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25楼2014-08-24 14:43:39
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陈曦0704

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 卓尔不凡2012 at 2013-06-22 20:00:51
本人欲PCR扩增一4200bp左右的目的基因片段，用过TaKaRa的LA酶、HS Taq酶，用过全式金的FastPfu Fly DNA Polymerase均无目的条带，很是郁闷，跑电泳时用0.5%的胶，100V跑25min，但加样孔处一直有很亮的一团:swe ...

请问楼主最后做出来了吗，是什么原因扩不出来呢

发自小木虫IOS客户端
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26楼2017-12-03 21:52:05
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