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卓尔不凡2012银虫 (正式写手)
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[求助]
欲PCR扩增4200bp左右的目的片段，一直得不到目的条带，求高人指教！已有2人参与
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本人欲PCR扩增一4200bp左右的目的基因片段，用过TaKaRa的LA酶、HS Taq酶，用过全式金的FastPfu Fly DNA Polymerase均无目的条带，很是郁闷 ，跑电泳时用0.5%的胶，100V跑25min，但加样孔处一直有很亮的一团 ，请高手指点，我怎样才能扩增出目的条带？？ 小木虫.jpg [ Last edited by 卓尔不凡2012 on 2013-6-22 at 20:02 ] |
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凌波丽
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【答案】应助回帖
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楼主可以改用长片段PCR扩增体系。 长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求 凌波丽 2014-7-11 3kb-20kb的DNA片段适用长片段PCR扩增。 1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。 2.当需要扩增的片段大于20kb时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了20kb,甜茶碱可以少加点。 3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。 4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KB时更是如此，变性时间长会破坏模板。 5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kb的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kb的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。 6.模板浓度最好在1ng/L以内。 7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。 8.设计较长的PCR引物（25-30 bp) 其他同同普通PCR。 参考一下。 |
25楼2014-08-24 14:43:39
overhalfmoon
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2楼2013-06-22 21:25:52
卓尔不凡2012
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3楼2013-06-22 21:40:01
cicelyzh
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4楼2013-06-23 01:34:35