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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 欲PCR扩增4200bp左右的目的片段，一直得不到目的条带，求高人指教！
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zhouking8758

木虫 (正式写手)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-20 11:54:00
降低退火温度，适当降低模板浓度（10ng/50ul就可以了），延长延伸时间。
此外，检查引物是否有问题，可以尝试用普通taq没尝试扩扩增。
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11楼2013-06-23 20:01:32
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
卓尔不凡2012: 金币+2 2013-06-24 15:44:07
模板要定量。量要根据物种的不用来确定。，一般哺乳类的模板50ul要1ug。。提的基因组质量要保障，260/280大约1.8左右，要跑胶看质量，测浓度后再做pcr，引物要合适，。扩增时间要正确，不同酶扩增效率不同，希望有帮助，可以多交流
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12楼2013-06-23 20:34:17
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丸子龙

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
卓尔不凡2012: 金币+1 2013-06-24 15:44:20
我也遇到这种问题，被困扰快一年了，各种条件都摸索过了，模板也做过10倍到100倍的稀释，退火温度也做过大量的梯度，但是都无济于事。
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13楼2013-06-24 07:48:27
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卓尔不凡2012

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by qiuqu_200212 at 2013-06-23 12:57:28
模版尽量是25微升体系，1微升也较多了。
还有就是尽量用酶活性大的公司酶。宝生物的酶活性是较低的品种。

你好，您建议用哪家公司的什么酶呢？
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14楼2013-06-24 08:40:33
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dcb005

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
卓尔不凡2012: 金币+1 2013-06-24 18:24:32
模板浓度太高，还有就是引物设计是否有问题
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★穷则独善其身,达则兼济天下★
15楼2013-06-24 11:39:36
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暖暖暖

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

稀释模板试试，另外如果引物退货温度不合适的话做个降落PCR试试。
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Only the strong survive.
16楼2013-07-19 21:16:11
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

CR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下：一．引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。对策：重新设计引物。二．Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度。三．靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。这种非特异性带出现可用以下方法解决：（1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。（2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。（3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。（4）重新提取模板DNA。2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。

相关的问题，我过去回答过，但是这次的回答做了补充和修改。最近我重要回答PCR的问题，还好，我自己正好近几日重写了一些实验操作总结，其中就有不止一篇有关PCR的，看那个问题符合我写的就直接粘帖上来，下周开始再接着总结一些，这周我是不写了。
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17楼2013-07-19 23:26:11
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下：一．引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。对策：重新设计引物。二．Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度。三．靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。这种非特异性带出现可用以下方法解决：（1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。（2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。（3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。（4）重新提取模板DNA。2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。

PCR扩增产物异常的相关的问题，我以前回答过，但是这次的回答做了补充和修改。最近我重要回答PCR的问题，还好，我自己正好近几日重写了一些实验操作总结（参考了实验手册的protocols 和 自己及别人的经验），其中就有不止一篇有关PCR的，看那个问题符合我写的就直接粘帖上来，下周开始再接着总结一些，这周我是不写了。
不好意思，粘帖总结时把PCR的P没有粘上，，更正一下。
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18楼2013-07-19 23:29:27
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

酶应该换为高保真的DNA聚合酶，如果已经是那么提示以下问题：
考虑使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。


1.更换所有缓冲溶液，使用全部新配的缓冲溶液。这点可能太基本了，很不被重视。
适当调高复性温度。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度；如果出现任何扩增带，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。
2.调整和更换DNA聚合酶，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。
3.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。
4.适当减低的dNTP的浓度，可以分梯度进行。
5.DNA模板的质量：反复冻融或者长期在冰箱的冷藏箱里，导致降解。测一下模板的分子量，必要的话对模板测序。

这四条是我刚刚改写有关PCR扩增不出特异性产物的总结的今天的补充。
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19楼2013-07-20 14:31:00
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

一般的调整顺序（不是绝对的）：若PCR反应后无任何产物，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。同时全部重新配所有的缓冲溶液。 然后调整引物浓度，在调整引物与模板的结合温度，调整变性和退火温度时间。接着或者与引物调整同时，把酶换成其他类型的DNA聚合酶（高保真酶或者热启动酶）。再往后，检测和重新提取DNA模板（包括用质谱或者电泳检测DNA是否变短，清除酚和SDS，检测模板浓度，必要时要对DNA模板测序）。再往后使用梯度降低dNTP。最后这些都做了仍未奏效，那么就要重新设计引物了。一般是最先调整Mg2+ 浓度，最后重新设计引物，其他顺序可变。

上贴的五条和本帖是我刚刚改写有关PCR扩增不出特异性产物的总结的今天的补充。
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20楼2013-07-20 14:43:36
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