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卓尔不凡2012银虫 (正式写手)
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[求助]
欲PCR扩增4200bp左右的目的片段，一直得不到目的条带，求高人指教！ 已有2人参与
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本人欲PCR扩增一4200bp左右的目的基因片段，用过TaKaRa的LA酶、HS Taq酶，用过全式金的FastPfu Fly DNA Polymerase均无目的条带，很是郁闷 ，跑电泳时用0.5%的胶，100V跑25min，但加样孔处一直有很亮的一团 ，请高手指点，我怎样才能扩增出目的条带？？ 小木虫.jpg [ Last edited by 卓尔不凡2012 on 2013-6-22 at 20:02 ] |
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【答案】应助回帖
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一般的调整顺序（不是绝对的）：若PCR反应后无任何产物，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。同时全部重新配所有的缓冲溶液。 然后调整引物浓度，在调整引物与模板的结合温度，调整变性和退火温度时间。接着或者与引物调整同时，把酶换成其他类型的DNA聚合酶（高保真酶或者热启动酶）。再往后，检测和重新提取DNA模板（包括用质谱或者电泳检测DNA是否变短，清除酚和SDS，检测模板浓度，必要时要对DNA模板测序）。再往后使用梯度降低dNTP。最后这些都做了仍未奏效，那么就要重新设计引物了。一般是最先调整Mg2+ 浓度，最后重新设计引物，其他顺序可变。 上贴的五条和本帖是我刚刚改写有关PCR扩增不出特异性产物的总结的今天的补充。 |
20楼2013-07-20 14:43:36
overhalfmoon
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2楼2013-06-22 21:25:52
卓尔不凡2012
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3楼2013-06-22 21:40:01
cicelyzh
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4楼2013-06-23 01:34:35