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卓尔不凡2012银虫 (正式写手)
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[求助]
欲PCR扩增4200bp左右的目的片段，一直得不到目的条带，求高人指教！已有2人参与
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本人欲PCR扩增一4200bp左右的目的基因片段，用过TaKaRa的LA酶、HS Taq酶，用过全式金的FastPfu Fly DNA Polymerase均无目的条带，很是郁闷 ，跑电泳时用0.5%的胶，100V跑25min，但加样孔处一直有很亮的一团 ，请高手指点，我怎样才能扩增出目的条带？？ 小木虫.jpg [ Last edited by 卓尔不凡2012 on 2013-6-22 at 20:02 ] |
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【答案】应助回帖
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酶应该换为高保真的DNA聚合酶，如果已经是那么提示以下问题： 考虑使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。 1.更换所有缓冲溶液，使用全部新配的缓冲溶液。这点可能太基本了，很不被重视。 适当调高复性温度。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度；如果出现任何扩增带，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。 2.调整和更换DNA聚合酶，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。 3.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。 4.适当减低的dNTP的浓度，可以分梯度进行。 5.DNA模板的质量：反复冻融或者长期在冰箱的冷藏箱里，导致降解。测一下模板的分子量，必要的话对模板测序。 这四条是我刚刚改写有关PCR扩增不出特异性产物的总结的今天的补充。 |
19楼2013-07-20 14:31:00
overhalfmoon
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2楼2013-06-22 21:25:52
卓尔不凡2012
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3楼2013-06-22 21:40:01
cicelyzh
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4楼2013-06-23 01:34:35