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卓尔不凡2012银虫 (正式写手)
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[求助]
欲PCR扩增4200bp左右的目的片段，一直得不到目的条带，求高人指教！已有2人参与
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本人欲PCR扩增一4200bp左右的目的基因片段，用过TaKaRa的LA酶、HS Taq酶，用过全式金的FastPfu Fly DNA Polymerase均无目的条带，很是郁闷 ，跑电泳时用0.5%的胶，100V跑25min，但加样孔处一直有很亮的一团 ，请高手指点，我怎样才能扩增出目的条带？？ 小木虫.jpg [ Last edited by 卓尔不凡2012 on 2013-6-22 at 20:02 ] |
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【答案】应助回帖
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CR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下：一．引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。对策：重新设计引物。二．Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度。三．靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。这种非特异性带出现可用以下方法解决：（1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。（2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。（3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。（4）重新提取模板DNA。2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。 相关的问题，我过去回答过，但是这次的回答做了补充和修改。最近我重要回答PCR的问题，还好，我自己正好近几日重写了一些实验操作总结，其中就有不止一篇有关PCR的，看那个问题符合我写的就直接粘帖上来，下周开始再接着总结一些，这周我是不写了。 |
17楼2013-07-19 23:26:11
overhalfmoon
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2楼2013-06-22 21:25:52
卓尔不凡2012
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3楼2013-06-22 21:40:01
cicelyzh
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4楼2013-06-23 01:34:35