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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » reverse PCR 线性化载体
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tubulifera

木虫 (正式写手)

[求助] reverse PCR 线性化载体已有3人参与

大家好，有谁用过clontech公司的Infusion cloning kit的，我用reverse PCR 对大小为10kb的载体线性化，然后与一个800bp的片段连接，在平板上也长了单菌落，但是测序发现，片段插入的位置不对，有些克隆与原载体比少了很多。请求大家给予帮助，是用PCR线性化的问题吗？还是其他的问题。在此先表示感谢！！
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1楼2014-10-09 08:00:20
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
聚合酶有时也有外切酶活性

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-10-09 20:06:21
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陌路行客

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-09 14:04:48
确定是单酶切位点吗？
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人生中的悲剧太多了
2楼2014-10-09 08:16:00
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tubulifera

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 陌路行客 at 2014-10-09 08:16:00
确定是单酶切位点吗？

没有酶切位点，我才选择用reverse PCR线性化，如果有酶切位点的话我就直接用酶切了。谢谢你的回复！
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4楼2014-10-10 09:04:32
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tubulifera

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by bio_sci at 2014-10-09 20:06:21
聚合酶有时也有外切酶活性

谢谢你的回复，你说的是在进行infusion PCR的时候切掉了然后重组？但我得到的每一个clones都能PCR检测到我的目的片段。
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5楼2014-10-10 10:38:41
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