| 查看: 6553 | 回复: 13 | |||||||||
panda73金虫 (小有名气)
|
[交流]
影响酶切的几个主要因素 已有7人参与
|
||||||||
|
影响酶切的几个主要因素： 1. 质粒DNA的质量 1）质粒DNA的质量是决定酶切效率的最最要的因素。通常在克隆时，如果反复优化酶切条件后，都不能实现完全酶切，最可能的原因就是质粒DNA的质量有问题。 2）DNA的质量监测通常有两个方法：首先OD260/OD280比值应该在1.8左右（1.7-1.9），否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。其次，琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主。最多不超过三条带（分别为超螺旋DNA，线性化DNA和环状DNA）。否则意味质粒DNA的质量不高，应该重新制备。 2.限制性内切酶的活性 1）限制性内切酶一般需要低温保存，而且反复的升降温过程对酶活性的损害很明显。因而为了确保在有效期内的限制性内切酶不会失活，限制性内切酶的日常保存和使用应当很小心。 2）建议购买具有保温功能的冻存盒保存限制性内切酶（-20度），而且取用限制性内切酶时，也应该使用具有保温功能的冻存盒，尽量防止酶的温度反复出现大的波动。 3.限制性内切酶的用量 1）限制性内切酶的单位定义通常为：在合适的温度下，完全消化1ugDNA底物所需的酶量定义为一个单位。 2）在这个单位定义中，有几个不确定因素：首先是底物，不同的酶单位定义是选择的底物可能不同（常用的几个底物DNA包括：Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些质粒DNA）；第二个不确定因素是限制性内切酶在底物DNA上的酶切位点的个数。由于单位定义中要求完全消化，因而底物上某个酶的酶切位点的个数的多少，就直接影响了该酶的单位定义。 3）因而，在进行酶切时，用1ul酶（一般10IU/ul）消化1ugDNA的通常做法是很不科学的，这也导致在实际工作中，大家要进行多次预实验才能确定最合适酶切条件。 4）以前，我推荐了一个在线的双酶切设计软件，double digestion designer, 可以精确地计算酶切时的限制性内切酶的用量。使用中，能够注意到，用来进行双酶切的两个酶的用量有时竟然相差近20倍（EcoRI + NheI)，而且发现，小片段PCR产物（100-500bp）进行酶切时，需要的酶量比质粒DNA酶切时用量多10倍以上。 5）该软件目前可以免费使用，用户名和密码都是test。http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php [ Last edited by panda73 on 2012-2-27 at 16:42 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 留学海外 | 分子生物学资料 | 分子生物实验相关 | 分子实验常见问题 |
| 测序 | 生物技术/方法讲解 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
酶切专家» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有273人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 双酶切后，质粒条带弥散
已经有13人回复
- 三螺旋DNA的设计应该注意什么
已经有6人回复
- 建库酶切问题求助！！
已经有20人回复
- 几个关键的时间点如何确定
已经有11人回复
- 纠结的分子实验，双酶切连不上，求助
已经有14人回复
- 在做酶切时不小心用质粒污染了酶,那酶还能用吗
已经有6人回复
- 怎样确定完全抑制酶活
已经有1人回复
- （侯氏出品）双酶切连接反应之全攻略
已经有89人回复
- 影响Si nanoparticle的initial coulombic efficiency的因素都有哪些啊
已经有8人回复
- 酶与果蔬加工Enzymes in Fruit and Vegetable Processing(2010)
已经有178人回复
- EcoRI 酶切细菌基因组切不开
已经有19人回复
- 关于酶解单因素的实验
已经有3人回复
- 分子标记，有没有抗感亲本没有差异，F2群体却发生分离的情况
已经有4人回复
- 16rRNA序列酶切后，带型相同的菌株被确认在哪个分类水平了？
已经有9人回复
- DFT计算和X射线发射光谱研究金属表面小分子吸附电子结构
已经有26人回复
- XcmI酶切不开的可能原因
已经有8人回复
- 酶切的影响因素
已经有3人回复
- 求教关于用QIAquick PCR Purification Kit 是否能用来回收双酶切过的pcr产物
已经有3人回复
- 新手想知道如何用Amber做蛋白质分子固定某两个或多个氨基酸距离的MD计算
已经有4人回复
- 【求助/交流】不完全酶切
已经有8人回复
- 【分享】使用cubegen程序做分子的total electronic densities
已经有8人回复
- 【求助/交流】影响酶切的因素？
已经有25人回复
酶切专家
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 2
- 应助: 96 (初中生)
- 金币: 1610.8
- 红花: 4
- 帖子: 149
- 在线: 41.3小时
- 虫号: 1648414
- 注册: 2012-02-27
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
2楼2012-02-28 10:57:03
十口心思
木虫 (小有名气)
- 应助: 16 (小学生)
- 金币: 2417.9
- 散金: 64
- 帖子: 261
- 在线: 152.7小时
- 虫号: 347022
- 注册: 2007-04-15
- 性别: GG
- 专业: 抗体工程学
5楼2012-02-29 11:03:03
十口心思
木虫 (小有名气)
- 应助: 16 (小学生)
- 金币: 2417.9
- 散金: 64
- 帖子: 261
- 在线: 152.7小时
- 虫号: 347022
- 注册: 2007-04-15
- 性别: GG
- 专业: 抗体工程学
3楼2012-02-29 01:11:50
panda73
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 3
- 应助: 80 (初中生)
- 金币: 1201.3
- 散金: 44
- 红花: 2
- 帖子: 191
- 在线: 42.5小时
- 虫号: 985964
- 注册: 2010-03-30
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
4楼2012-02-29 09:53:34
6楼2012-02-29 17:34:53
7楼2012-03-05 13:52:43
amilie030312
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 2
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 644.8
- 帖子: 407
- 在线: 47.3小时
- 虫号: 296900
- 注册: 2006-11-18
- 专业: 动物遗传学
8楼2012-03-05 16:02:50
9楼2012-03-05 16:35:01
panda73
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 3
- 应助: 80 (初中生)
- 金币: 1201.3
- 散金: 44
- 红花: 2
- 帖子: 191
- 在线: 42.5小时
- 虫号: 985964
- 注册: 2010-03-30
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
10楼2012-03-05 21:56:30
10