24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

panda73

金虫 (小有名气)

MolEPI: 3
应助: 80 (初中生)
金币: 1201.3
散金: 44
红花: 2
帖子: 191
在线: 42.5小时
虫号: 985964
注册: 2010-03-30
性别: GG
专业: 生物大分子结构与功能

[交流] 影响酶切的几个主要因素已有7人参与

影响酶切的几个主要因素：
1. 质粒DNA的质量
1）质粒DNA的质量是决定酶切效率的最最要的因素。通常在克隆时，如果反复优化酶切条件后，都不能实现完全酶切，最可能的原因就是质粒DNA的质量有问题。
2）DNA的质量监测通常有两个方法：首先OD260/OD280比值应该在1.8左右（1.7-1.9），否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。其次，琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主。最多不超过三条带（分别为超螺旋DNA，线性化DNA和环状DNA）。否则意味质粒DNA的质量不高，应该重新制备。

2.限制性内切酶的活性
1）限制性内切酶一般需要低温保存，而且反复的升降温过程对酶活性的损害很明显。因而为了确保在有效期内的限制性内切酶不会失活，限制性内切酶的日常保存和使用应当很小心。
2）建议购买具有保温功能的冻存盒保存限制性内切酶（-20度），而且取用限制性内切酶时，也应该使用具有保温功能的冻存盒，尽量防止酶的温度反复出现大的波动。

3.限制性内切酶的用量
1）限制性内切酶的单位定义通常为：在合适的温度下，完全消化1ugDNA底物所需的酶量定义为一个单位。
2）在这个单位定义中，有几个不确定因素：首先是底物，不同的酶单位定义是选择的底物可能不同（常用的几个底物DNA包括：Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些质粒DNA）；第二个不确定因素是限制性内切酶在底物DNA上的酶切位点的个数。由于单位定义中要求完全消化，因而底物上某个酶的酶切位点的个数的多少，就直接影响了该酶的单位定义。
3）因而，在进行酶切时，用1ul酶（一般10IU/ul）消化1ugDNA的通常做法是很不科学的，这也导致在实际工作中，大家要进行多次预实验才能确定最合适酶切条件。
4）以前，我推荐了一个在线的双酶切设计软件，double digestion designer, 可以精确地计算酶切时的限制性内切酶的用量。使用中，能够注意到，用来进行双酶切的两个酶的用量有时竟然相差近20倍（EcoRI + NheI)，而且发现，小片段PCR产物（100-500bp）进行酶切时，需要的酶量比质粒DNA酶切时用量多10倍以上。
5）该软件目前可以免费使用，用户名和密码都是test。http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php

[ Last edited by panda73 on 2012-2-27 at 16:42 ]

回复此楼