应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » EcoRI 酶切细菌基因组切不开
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
201/2返回列表12下一页
查看: 3727  |  回复: 19
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

w26150665w

铜虫 (正式写手)

[求助] EcoRI 酶切细菌基因组切不开

为什么我用20ul体系酶切基因组切不开，酶切体系：ddH2O ；基因组1.5-2ul（OD比为1.85，纯度应该没问题）；10*H缓冲液 2ul；酶 0.4ul。酶切时间梯度6、7、8、9、10小时，结果仍然切不开基因组，请高手帮帮忙，不胜感激！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
多多交流学习
1楼 2012-03-22 18:26:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

XOooZzz

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+4, Good！ 2012-03-25 14:25:14
引用回帖:
5楼: Originally posted by w26150665w at 2012-03-23 09:50:37:
NCBI可以搜索到该细菌属中已被测序的，全基因组序列上有改酶切位点的，900多个啊。但是我疯狂地切，还是切不动，DNA纯度应该是没问题的。

我的意思是基因组的ecorI位点被保护起来 了，譬如说甲基化什么的。

如果你确保酶没问题，那么换别的酶试试譬如说hindiii，sau3ai
如果都切不开，该考虑你提到基因组是否有问题。譬如说有蛋白残留，与dna结合的蛋白可能会抑制酶切，估计要再抽提一下，或者残留有乙醇之类。
其它的我也想不到什么原因了，等高手咯

方便的话，上个图让大家looklook吧
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2012-03-23 10:27:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 好吧，我记得你，你还在推荐你的软件呢 2012-03-23 14:41:52
w26150665w: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-03-23 22:17:45
有两个问题：
你的基因组DNA定量时，浓度时多少？也就是你酶切时的DNA总量是多少？
你的buffer是H,应该用的是Takara的酶吧，你用其他有EcoRI位点的质粒测试过你的酶吗？没准，你的酶因为存储不当，已经失活了。
如果上述两个问题，你都清楚了，我建议你用Double digestion designer设计你的酶切反应体系。
http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php，可以申请免费使用。
我前不久，刚利用此系统成功设计了一个很困难的部分酶切，还不错，你可以试一试，希望对你有帮助。
赞一下 回复此楼
2楼2012-03-22 20:34:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
什么细菌呢？是不定你的菌株对EcoRI酶切位点进行修饰了。譬如说生产EcoRI酶的工程菌的基因组就不能被该酶切开吧？
赞一下 回复此楼
3楼2012-03-22 21:38:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

w26150665w

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-03-22 20:34:09:
有两个问题：
你的基因组DNA定量时，浓度时多少？也就是你酶切时的DNA总量是多少？
你的buffer是H,应该用的是Takara的酶吧，你用其他有EcoRI位点的质粒测试过你的酶吗？没准，你的酶因为存储不当，已经失活了。 ...

谢谢，我的DNA纯度在抽提后测了吸光值的，就是1.05ug/ul，我在酶切反应中加了4ul、2ul、1.5ul都切不开的，每次反应的时间呈梯度6-10小时。今天做1ul的。因为师兄用过酶，EcoRI 说是没问题，我用NdeI 切过10小时，也是没切开。
试验进度卡住了。。。很急。。。
赞一下 回复此楼
多多交流学习
4楼2012-03-23 09:48:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

w26150665w

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by XOooZzz at 2012-03-22 21:38:58:
什么细菌呢？是不定你的菌株对EcoRI酶切位点进行修饰了。譬如说生产EcoRI酶的工程菌的基因组就不能被该酶切开吧？

NCBI可以搜索到该细菌属中已被测序的，全基因组序列上有改酶切位点的，900多个啊。但是我疯狂地切，还是切不动，DNA纯度应该是没问题的。
赞一下 回复此楼
多多交流学习
5楼2012-03-23 09:50:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Im_suvii

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励 2012-03-25 14:24:50
基因测序过么?会不会酶切位点发生了突变？如果序列正确，是不是被甲基化了或者酶有问题？
赞一下 回复此楼
小楼一夜听春雨,明朝深巷卖杏花
7楼2012-03-23 11:32:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

w26150665w

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Im_suvii at 2012-03-23 11:32:20:
基因测序过么?会不会酶切位点发生了突变？如果序列正确，是不是被甲基化了或者酶有问题？

谢谢，没测过序，但是16S鉴定过菌属。如果是基因内部的问题，那我就只能重抽了。
赞一下 回复此楼
多多交流学习
8楼2012-03-23 14:17:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

w26150665w

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by XOooZzz at 2012-03-23 10:27:18:
我的意思是基因组的ecorI位点被保护起来 了，譬如说甲基化什么的。

如果你确保酶没问题，那么换别的酶试试譬如说hindiii，sau3ai
如果都切不开，该考虑你提到基因组是否有问题。譬如说有蛋白残留，与dna结合 ...

嗯，谢谢。因为 我的质粒用EcoRI 是可以切开的 说明酶没有问题，我也用ndeI 切了，也是没切开。基因组OD260/od280=1.85，纯了吧，残留乙醇。。。有可能。。。我快投降了。。。
赞一下 回复此楼
多多交流学习
9楼2012-03-23 14:22:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

w26150665w

铜虫 (正式写手)
西瓜: 回帖置顶 2012-03-25 14:24:53
这是酶切图，左到右为Marker，酶切前，6，7，8，9，10小时酶切结果。

这是酶切图，左到右为Marker，酶切前，6，7，8，9，10小时酶切结果。
赞一下 回复此楼
多多交流学习
10楼2012-03-23 14:32:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 w26150665w 的主题更新
201/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿北京科技大学085601材料工程英一数二初试总分335求调剂 +6 双马尾痞老板2 2026-04-01 6/300 2026-04-01 23:33 by chaolymer
[考研] 11408 321分求调剂 +3 huchun12138 2026-03-30 4/200 2026-04-01 22:48 by guanxin1001
[考研] 349求调剂 +6 吃的不少 2026-04-01 6/300 2026-04-01 17:55 by JYD2011
[考研] 26考研调剂 +3 Wnz.20030617 2026-04-01 3/150 2026-04-01 17:22 by salamander`
[考研] 086502化学工程342求调剂 +7 阿姨复古不过 2026-03-27 7/350 2026-04-01 16:14 by yanflower7133
[考研] 0703化学/290求调剂/本科经历丰富/工科也可 +14 丹青奶盖 2026-03-26 16/800 2026-04-01 15:58 by oooqiao
[考研] 一志愿天津大学339材料与化工求调剂 +4 江往卖鱼 2026-03-26 4/200 2026-04-01 09:25 by oooqiao
[考研] 333求调剂 +4 阿科逸 2026-03-31 4/200 2026-04-01 09:11 by jp9609
[考研] 0856材料与化工调剂，339 +10 10213207 2026-03-31 10/500 2026-04-01 08:28 by Linda Hu
[考研] 322求调剂 +4 熹僖XX 2026-03-31 4/200 2026-04-01 08:21 by JourneyLucky
[考研] 一志愿北京科技大学材料学硕328分求调剂 +4 1段时间 2026-03-31 5/250 2026-03-31 19:56 by wxiongid
[考研] 375求调剂 +7 雨夏整夜 2026-03-29 7/350 2026-03-31 18:52 by xhai2011
[考研] 合肥区域性重点一本招收调剂 +4 6266jl 2026-03-30 8/400 2026-03-31 18:43 by 6266jl
[考研] 340求调剂 +4 希望如此i 2026-03-31 4/200 2026-03-31 16:40 by 690616278
[考研] 南京大学化学调剂 +11 景随风 2026-03-29 16/800 2026-03-31 10:14 by herarysara
[考研] 一志愿食品科学与工程083200求调剂 +4 XQTJZ 2026-03-30 4/200 2026-03-31 04:10 by fmesaito
[考研] 329求调剂 +8 星野? 2026-03-26 8/400 2026-03-30 13:41 by chemdavid
[考研] 085405 考的11408求各位老师带走 +3 Qiu学ing 2026-03-28 3/150 2026-03-28 09:19 by 乐呵呵的追梦人
[考研] 265求调剂 +8 小木虫085600 2026-03-27 8/400 2026-03-27 22:16 by 无际的草原
[考研] 321求调剂 +6 wasdssaa 2026-03-26 6/300 2026-03-26 20:57 by sanrepian
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭