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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » EcoRI 酶切细菌基因组切不开
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铜虫 (正式写手)

[求助] EcoRI 酶切细菌基因组切不开

为什么我用20ul体系酶切基因组切不开，酶切体系：ddH2O ；基因组1.5-2ul（OD比为1.85，纯度应该没问题）；10*H缓冲液 2ul；酶 0.4ul。酶切时间梯度6、7、8、9、10小时，结果仍然切不开基因组，请高手帮帮忙，不胜感激！
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1楼2012-03-22 18:26:02
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铜虫 (正式写手)
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2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-03-22 20:34:09:
有两个问题：
你的基因组DNA定量时，浓度时多少？也就是你酶切时的DNA总量是多少？
你的buffer是H,应该用的是Takara的酶吧，你用其他有EcoRI位点的质粒测试过你的酶吗？没准，你的酶因为存储不当，已经失活了。 ...

谢谢，我的DNA纯度在抽提后测了吸光值的，就是1.05ug/ul，我在酶切反应中加了4ul、2ul、1.5ul都切不开的，每次反应的时间呈梯度6-10小时。今天做1ul的。因为师兄用过酶，EcoRI 说是没问题，我用NdeI 切过10小时，也是没切开。
试验进度卡住了。。。很急。。。
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4楼2012-03-23 09:48:57
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铜虫 (正式写手)
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3楼: Originally posted by XOooZzz at 2012-03-22 21:38:58:
什么细菌呢？是不定你的菌株对EcoRI酶切位点进行修饰了。譬如说生产EcoRI酶的工程菌的基因组就不能被该酶切开吧？

NCBI可以搜索到该细菌属中已被测序的，全基因组序列上有改酶切位点的，900多个啊。但是我疯狂地切，还是切不动，DNA纯度应该是没问题的。
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5楼2012-03-23 09:50:37
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铜虫 (正式写手)
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7楼: Originally posted by Im_suvii at 2012-03-23 11:32:20:
基因测序过么?会不会酶切位点发生了突变？如果序列正确，是不是被甲基化了或者酶有问题？

谢谢，没测过序，但是16S鉴定过菌属。如果是基因内部的问题，那我就只能重抽了。
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8楼2012-03-23 14:17:01
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铜虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by XOooZzz at 2012-03-23 10:27:18:
我的意思是基因组的ecorI位点被保护起来 了，譬如说甲基化什么的。

如果你确保酶没问题，那么换别的酶试试譬如说hindiii，sau3ai
如果都切不开，该考虑你提到基因组是否有问题。譬如说有蛋白残留，与dna结合 ...

嗯，谢谢。因为 我的质粒用EcoRI 是可以切开的 说明酶没有问题，我也用ndeI 切了，也是没切开。基因组OD260/od280=1.85，纯了吧，残留乙醇。。。有可能。。。我快投降了。。。
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9楼2012-03-23 14:22:18
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铜虫 (正式写手)
西瓜: 回帖置顶 2012-03-25 14:24:53
这是酶切图，左到右为Marker，酶切前，6，7，8，9，10小时酶切结果。

这是酶切图，左到右为Marker，酶切前，6，7，8，9，10小时酶切结果。
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10楼2012-03-23 14:32:09
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铜虫 (正式写手)
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11楼: Originally posted by lwtong8320 at 2012-03-23 19:42:45:
，帮顶一下！

你的基因组总DNA是用试剂盒提的，还是手提的呀？里面是不是有什么东西在干扰呀，要不用无水乙醇沉淀一下，再试试，要不干脆重新提一次吧！

呵呵 手提
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13楼2012-03-23 22:13:52
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铜虫 (正式写手)
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12楼: Originally posted by lincy2010 at 2012-03-23 21:27:40:
我没切过大基因组，但就我切大质粒（45kb左右）时发现很明显切出来小的片断很暗，不仔细看基本看不出，条带的亮度随片断大小的增大而增大，最小的300bp与最大的27kb的亮度相差相当大（见附图，共6条，右边是marke ...

嗯 很大 今晚切动了好像 是我体系的问题 谢谢大伙
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14楼2012-03-23 22:15:23
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铜虫 (正式写手)
感谢大家的建议和分析，今晚我调整了体系，切切看，明天再做个电泳，希望能和大家继续讨论。不过我真觉得自己手抽的比试剂盒还要纯。
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15楼2012-03-23 22:20:18
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铜虫 (正式写手)
西瓜: 回帖置顶 2012-03-25 14:26:26
昨天的电泳跑出了类似“拖尾”的条带，是不是说明我切开了啊，各位？

左到右：切前，切3、4h后
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17楼2012-03-24 15:42:01
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