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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】为什么条带很细啊？郁闷呢！
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350784478

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】为什么条带很细啊？郁闷呢！ 已有4人参与

您好！我最近在提蛋白做Western blot，我是用碧云天裂解液裂解肿瘤组织（-80°放置一个月吧），然后再加入PMSF，冰上研磨10分钟，倒入EP管中，超声波振荡15s，13000rpm，4°离心15min，然后就发现EP管上面有白色的东西，非常粘稠，请问一下这个是蛋白吗？
再次，上样的体积是20ul，电泳完之后采用考马斯亮蓝染色。染出结果很差，每次条带都很细，基本看不到，即使我把体积加大，也还是没有什么变化啊，这个是什么原因呢？还请各位帮忙解决我的困惑，非常感谢。
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朝为田舍郎，暮登天子堂。将相本无种，男儿当自强。
1楼 2010-11-19 18:01:46
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oditors

银虫 (小有名气)
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-24 08:22:17
你有没有参考他的说明书啊？我现在也在用碧云天的蛋白裂解液，但是我的那个PMSF是要用的时候就加到裂解液里面的！你去看看他的说明书吧
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2楼2010-11-24 01:09:13
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350784478

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by oditors at 2010-11-24 01:09:13:
你有没有参考他的说明书啊？我现在也在用碧云天的蛋白裂解液，但是我的那个PMSF是要用的时候就加到裂解液里面的！你去看看他的说明书吧

我也是要用的时候加的，用之前几分钟加的。都不知道是哪方面出现问题的。
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朝为田舍郎，暮登天子堂。将相本无种，男儿当自强。
3楼2010-11-24 12:38:14
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oditors

银虫 (小有名气)
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引用回帖:
Originally posted by 350784478 at 2010-11-24 12:38:14:

我也是要用的时候加的，用之前几分钟加的。都不知道是哪方面出现问题的。

你前面不是说你加了裂解液在组织里面过来一个月再加PMSF吗？还有一个就是你裂解的不充分，蛋白太少了！我做细胞的就是这样，裂解之后测浓度，显示浓度太低了，建议你有条件的话就进行浓缩，没条件就减少裂解液，增加组织以及裂解时间来提高蛋白浓度！
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4楼2010-11-24 13:45:38
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350784478

木虫 (正式写手)
[quote]Originally posted by oditors at 2010-11-24 13:45:38:

你前面不是说你加了裂解液在组织里面过来一个月再加PMSF吗？还有一个就是你裂解的不充分，蛋白太少了！我做细胞的就是这样，裂解之后测浓度，显示浓度太低了，建议你有条件的话就进行浓缩，没条件就减少裂解液， ... [/quote
对不起，是我说的没有清楚，我的意思是肿瘤组织-80°放置了一个月，然后我才提蛋白的，而不是裂解液。
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朝为田舍郎，暮登天子堂。将相本无种，男儿当自强。
5楼2010-11-24 16:31:33
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oditors

银虫 (小有名气)
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引用回帖:
Originally posted by 350784478 at 2010-11-24 16:31:33:
[quote]Originally posted by oditors at 2010-11-24 13:45:38:

你前面不是说你加了裂解液在组织里面过来一个月再加PMSF吗？还有一个就是你裂解的不充分，蛋白太少了！我做细胞的就是这样，裂解之后测浓 ...

哦哦，呵呵。那应该是裂解下来的蛋白了太少了，我现在也在犯这个问题
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6楼2010-11-24 18:19:03
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
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lstt09nk(金币+2):感谢交流，热心 2010-11-25 14:17:39
原因应该是组织或细胞太少，表达量太低。
PMSF什么时候加影响不会太大，PMSF只是蛋白酶抑制剂，不加也不一定就是讲解。加了也不一定不会降解。
楼主可以把组织直接用少量液体（什么液体不重要）悬浮，然后沸水煮几分钟，直接上样电泳。
比如你取一点组织在100ul水中，加入loading buffer,煮了后电泳就ok了。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
7楼2010-11-24 18:31:44
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350784478

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by oditors at 2010-11-24 18:19:03:

哦哦，呵呵。那应该是裂解下来的蛋白了太少了，我现在也在犯这个问题

关键是我做提取细胞的时候，就不会出现这样的情况，我细胞提取蛋白很好，一点问题都没有。
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朝为田舍郎，暮登天子堂。将相本无种，男儿当自强。
8楼2010-11-25 11:29:30
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oditors

银虫 (小有名气)
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引用回帖:
Originally posted by 350784478 at 2010-11-25 11:29:30:

关键是我做提取细胞的时候，就不会出现这样的情况，我细胞提取蛋白很好，一点问题都没有。

这个应该这样说，养的细胞都是比较分散的，容易裂解，而组织块，细胞太多，不易裂解，建议增加裂解时间。
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9楼2010-11-25 18:21:13
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wind-flying

铜虫 (初入文坛)
★
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1.是蛋白
2.蛋白浓度太低，提蛋白前细胞太少
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Travelingaroundtheworld
10楼2014-04-23 12:52:27
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