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350784478

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】为什么条带很细啊?郁闷呢!已有4人参与

您好!我最近在提蛋白做Western blot,我是用碧云天裂解液裂解肿瘤组织(-80°放置一个月吧),然后再加入PMSF,冰上研磨10分钟,倒入EP管中,超声波振荡15s,13000rpm,4°离心15min,然后就发现EP管上面有白色的东西,非常粘稠,请问一下这个是蛋白吗?
再次,上样的体积是20ul,电泳完之后采用考马斯亮蓝染色。染出结果很差,每次条带都很细,基本看不到,即使我把体积加大,也还是没有什么变化啊,这个是什么原因呢?还请各位帮忙解决我的困惑,非常感谢。
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朝为田舍郎,暮登天子堂。将相本无种,男儿当自强。
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oditors

银虫 (小有名气)

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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-24 08:22:17
你有没有参考他的说明书啊?我现在也在用碧云天的蛋白裂解液,但是我的那个PMSF是要用的时候就加到裂解液里面的!你去看看他的说明书吧
2楼2010-11-24 01:09:13
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350784478

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by oditors at 2010-11-24 01:09:13:
你有没有参考他的说明书啊?我现在也在用碧云天的蛋白裂解液,但是我的那个PMSF是要用的时候就加到裂解液里面的!你去看看他的说明书吧

我也是要用的时候加的,用之前几分钟加的。都不知道是哪方面出现问题的。
朝为田舍郎,暮登天子堂。将相本无种,男儿当自强。
3楼2010-11-24 12:38:14
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oditors

银虫 (小有名气)


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Originally posted by 350784478 at 2010-11-24 12:38:14:

我也是要用的时候加的,用之前几分钟加的。都不知道是哪方面出现问题的。

你前面不是说你加了裂解液在组织里面过来一个月再加PMSF吗?还有一个就是你裂解的不充分,蛋白太少了!我做细胞的就是这样,裂解之后测浓度,显示浓度太低了,建议你有条件的话就进行浓缩,没条件就减少裂解液,增加组织以及裂解时间来提高蛋白浓度!
4楼2010-11-24 13:45:38
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350784478

木虫 (正式写手)

[quote]Originally posted by oditors at 2010-11-24 13:45:38:

你前面不是说你加了裂解液在组织里面过来一个月再加PMSF吗?还有一个就是你裂解的不充分,蛋白太少了!我做细胞的就是这样,裂解之后测浓度,显示浓度太低了,建议你有条件的话就进行浓缩,没条件就减少裂解液, ... [/quote
对不起,是我说的没有清楚,我的意思是肿瘤组织-80°放置了一个月,然后我才提蛋白的,而不是裂解液。
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5楼2010-11-24 16:31:33
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oditors

银虫 (小有名气)


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Originally posted by 350784478 at 2010-11-24 16:31:33:
[quote]Originally posted by oditors at 2010-11-24 13:45:38:

你前面不是说你加了裂解液在组织里面过来一个月再加PMSF吗?还有一个就是你裂解的不充分,蛋白太少了!我做细胞的就是这样,裂解之后测浓 ...

哦哦,呵呵。那应该是裂解下来的蛋白了太少了,我现在也在犯这个问题
6楼2010-11-24 18:19:03
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

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lstt09nk(金币+2):感谢交流,热心 2010-11-25 14:17:39
原因应该是组织或细胞太少,表达量太低。
PMSF什么时候加影响不会太大,PMSF只是蛋白酶抑制剂,不加也不一定就是讲解。加了也不一定不会降解。
楼主可以把组织直接用少量液体(什么液体不重要)悬浮,然后沸水煮几分钟,直接上样电泳。
比如你取一点组织在100ul水中,加入loading buffer,煮了后电泳就ok了。
生物资源交流QQ群:1044518333
7楼2010-11-24 18:31:44
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350784478

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by oditors at 2010-11-24 18:19:03:

哦哦,呵呵。那应该是裂解下来的蛋白了太少了,我现在也在犯这个问题

关键是我做提取细胞的时候,就不会出现这样的情况,我细胞提取蛋白很好,一点问题都没有。
朝为田舍郎,暮登天子堂。将相本无种,男儿当自强。
8楼2010-11-25 11:29:30
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oditors

银虫 (小有名气)


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Originally posted by 350784478 at 2010-11-25 11:29:30:

关键是我做提取细胞的时候,就不会出现这样的情况,我细胞提取蛋白很好,一点问题都没有。

这个应该这样说,养的细胞都是比较分散的,容易裂解,而组织块,细胞太多,不易裂解,建议增加裂解时间。
9楼2010-11-25 18:21:13
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wind-flying

铜虫 (初入文坛)


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1.是蛋白
2.蛋白浓度太低,提蛋白前细胞太少
Travelingaroundtheworld
10楼2014-04-23 12:52:27
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