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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 为什么考马斯亮蓝染色能看到我要的条带，weston却看不到呢？
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小新3858

木虫 (正式写手)

[求助] 为什么考马斯亮蓝染色能看到我要的条带，weston却看不到呢？

RT，我每次做电泳都是做两块，一块考马斯亮蓝染色，一块做weston，每次都是考染有条带，weston却看不到，，我做weston做的不多，大侠们帮忙分析一下原因
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1楼 2011-06-22 09:08:20
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zsy1106

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 很热心 2011-06-22 17:23:24
考染没问题只能说明跑胶的步骤应该是没问题的，但western（楼主拼错啦）做不出来就有很多可能了：
转膜步骤：滤纸、胶、膜顺序有没有放错？
               气泡有没有赶干净？
               电极有没有插反？
               电转液有没有配错？
免疫反应：抗体有没有问题？确定可以和你的目的蛋白结合么？
               显色液有没有配错啊？
可能存在的问题要楼主小心求证了。
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4楼2011-06-22 10:16:29
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小新3858(金币+2): 2011-06-22 12:29:52
lstt09nk(金币+2): 感谢交流 2011-06-22 17:23:10
引用回帖:
Originally posted by 小新3858 at 2011-06-22 09:08:20:
RT，我每次做电泳都是做两块，一块考马斯亮蓝染色，一块做weston，每次都是考染有条带，weston却看不到，，我做weston做的不多，大侠们帮忙分析一下原因

说的有些不清楚哦
1.跑胶也是western的一部分哦，你的意思是说胶用考染，转膜后再染就看不到了吧。
2.转膜后是用丽春红染，你是用什么染的那？
3.看不到东西，首先确定你转膜是否成功，有没有蛋白转上去或者是转过去了。
如果能说的具体些，就更容易分析问题了。
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2楼2011-06-22 09:25:15
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小新3858

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 睡着数绵羊 at 2011-06-22 09:25:15:
说的有些不清楚哦
1.跑胶也是western的一部分哦，你的意思是说胶用考染，转膜后再染就看不到了吧。
2.转膜后是用丽春红染，你是用什么染的那？
3.看不到东西，首先确定你转膜是否成功，有没有蛋白转上去或者 ...

是这样的我每次做两个同样的SDS-PAGE，就是上一样的样品，SDS-PAGE跑完之后，一块用考马斯亮蓝染上，另一块就转膜，然后第二天考马斯亮蓝染色的进行脱色，另一个转到膜上的加一抗二抗进行显影
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3楼2011-06-22 10:02:43
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didillytao

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-06-22 17:23:37
如果你能确定染出来的条带是你要的话,那么应该是western的转膜,一抗,二抗,ecl中某个出了问题.不知道你们是不是湿转,膜在半干的状态下也能看到蛋白条带,你可以看一看确定有没有蛋白转到膜上,还有就是一抗和二抗的验证,二抗直接滴在膜上加ECL显色就可以验证好不好用,效价怎么样,而一抗的话以前用过吗?显色是没问题的吗?有没有过期之类的,而且ECL底物发光时间是有时限的,有些比较灵敏的ECL发光时间很短,如果动作慢可能荧光就会猝灭了,我觉得原因很多,楼主看一看哪项更有可能,希望能帮到你~~
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小鹿~~
5楼2011-06-22 10:16:36
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zsy1106

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

忘记讲了，有些步骤，可以的话，设立control组，可能更容易找出问题哦
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6楼2011-06-22 10:19:44
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小新3858

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zsy1106 at 2011-06-22 10:16:29:
考染没问题只能说明跑胶的步骤应该是没问题的，但western（楼主拼错啦）做不出来就有很多可能了：
转膜步骤：滤纸、胶、膜顺序有没有放错？
               气泡有没有赶干净？
               电极有没有插 ...

谢谢
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7楼2011-06-22 14:27:16
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小新3858

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by didillytao at 2011-06-22 10:16:36:
如果你能确定染出来的条带是你要的话,那么应该是western的转膜,一抗,二抗,ecl中某个出了问题.不知道你们是不是湿转,膜在半干的状态下也能看到蛋白条带,你可以看一看确定有没有蛋白转到膜上,还有就是一抗和二抗的验 ...

谢谢
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8楼2011-06-22 14:27:49
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 小新3858 at 2011-06-22 10:02:43:
是这样的我每次做两个同样的SDS-PAGE，就是上一样的样品，SDS-PAGE跑完之后，一块用考马斯亮蓝染上，另一块就转膜，然后第二天考马斯亮蓝染色的进行脱色，另一个转到膜上的加一抗二抗进行显影

转膜的时间可能没有掌握好哦，还得再摸索下，还有转膜液中是否存在SDS，也是很有影响的。
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9楼2011-06-23 09:12:02
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terry130

木虫 (正式写手)
考染看到的是所有蛋白，WB检测的是你的目的蛋白，有时候size一样却不是你要的蛋白是很正常的哦。另外你没必要做两张膜，做WB之前或者之后都可以用立春红去染色的，是可逆的，不影响WB效果。
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摒气动方息，宁神心自明。
10楼2011-06-23 10:49:04
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