应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒pPICZA酶切问题
61/1返回列表
查看: 1715  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

qingsong35

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】质粒pPICZA酶切问题 已有3人参与

请问有人用过SacII和PmlI对pPICZA进行过双酶切吗？我用的是NEB的酶，用SacII和PmlI双酶切质粒pPICZA和PCR产物（1Kb），酶切缓冲液和质粒的量都严格按照说明书进行，并切了12h。然后进行连接转化，提取转化子质粒发现这些转化子都是假阳性，提取出的质粒的大小与载体pPICZA相当，这应该是载体自连导致的。请问是不是用SacII和PmlI很难将pPICZA酶切干净？谢谢
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2010-05-19 14:29:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hyw1989960

木虫 (正式写手)

快乐家族二十八
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你不要告诉我，你酶切后没回收，就连接了，酶切后要将载体片段回收再连接。。。。双酶切载体基本上不自连。。
赞一下(1人) 回复此楼
快乐家族
2楼2010-05-19 14:37:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zestyhuan

新虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):欢迎新虫多多交流~~ 2010-05-19 16:32:26
双切不行可试试分步切，不过要回收两次可能损失较大。一般双切粘末端的话还是比较好连接的。
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2010-05-19 16:27:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qingsong35

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by hyw1989960 at 2010-05-19 14:37:28:
你不要告诉我，你酶切后没回收，就连接了，酶切后要将载体片段回收再连接。。。。双酶切载体基本上不自连。。

呵呵，那怎么可能不回收就去连接呢。载体和PCR产物酶切12h后，利用QIAGENE的试剂盒进行纯化，然后才去连接的。切了那么久还是自连，郁闷啊
赞一下 回复此楼
4楼2010-05-19 21:50:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qingsong35

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zestyhuan at 2010-05-19 16:27:17:
双切不行可试试分步切，不过要回收两次可能损失较大。一般双切粘末端的话还是比较好连接的。

唉，只能试试分步酶切了。那两个酶一个是产生平末端，一个是粘性末端，要是载体被两个酶切了不应该会自连啊请教一下，那我的PCR产物是不是也应该要分步去切呢？

[ Last edited by qingsong35 on 2010-5-19 at 21:59 ]
赞一下 回复此楼
5楼2010-05-19 21:53:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zestyhuan

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
一端平一端粘是不太好连的，我做过粘端补平后一平一粘的连接，我的连接方法是连接前载体和目的片段65度10分，冰上1分后加连接酶16度过夜的。根据载体和目的片段的浓度调整连接的量。你的PCR产物不连T载体吗？
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2010-05-20 10:16:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 qingsong35 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 085601专硕，总分342求调剂，地区不限 +5 share_joy 2026-03-16 5/250 2026-03-18 14:48 by haxia
[教师之家] 焦虑 +8 水冰月月野兔 2026-03-13 11/550 2026-03-18 13:10 by 水冰月月野兔
[考研] 308求调剂 +4 是Lupa啊 2026-03-16 4/200 2026-03-17 17:12 by ruiyingmiao
[考研] 一志愿苏州大学材料工程（085601）专硕有科研经历三项国奖两个实用型专利一项省级立项 +6 大火山小火山 2026-03-16 8/400 2026-03-17 15:05 by 无懈可击111
[考研] 211本，11408一志愿中科院277分，曾在中科院自动化所实习 +6 Losir 2026-03-12 7/350 2026-03-17 12:09 by danranxie
[考研] 275求调剂 +4 太阳花天天开心 2026-03-16 4/200 2026-03-17 10:53 by 功夫疯狂
[考研] 321求调剂 +5 大米饭！ 2026-03-15 5/250 2026-03-16 16:33 by houyaoxu
[考研] 070300化学学硕求调剂 +6 太想进步了0608 2026-03-16 6/300 2026-03-16 16:13 by kykm678
[考研] 085600材料与化工 求调剂 +13 enenenhui 2026-03-13 14/700 2026-03-16 15:19 by 了了了了。。
[考研] 材料与化工 323 英一+数二+物化，一志愿：哈工大 本人本科双一流 +4 自由的_飞翔 2026-03-13 5/250 2026-03-14 19:39 by hmn_wj
[考研] 中科大材料专硕319求调剂 +3 孟鑫材料 2026-03-13 3/150 2026-03-14 18:10 by houyaoxu
[考研] 材料080500调剂求收留 +3 一颗meteor 2026-03-13 3/150 2026-03-14 10:54 by peike
[考研] 281求调剂 +9 Koxui 2026-03-12 11/550 2026-03-13 20:50 by Koxui
[考研] 26调剂/材料科学与工程/总分295/求收留 +9 2026调剂侠 2026-03-12 9/450 2026-03-13 20:46 by 18595523086
[考研] 求调剂 +5 一定有学上- 2026-03-12 5/250 2026-03-13 18:31 by ms629
[考研] 求调剂 +7 18880831720 2026-03-11 7/350 2026-03-13 16:10 by JourneyLucky
[考研] 考研调剂 +4 芬达46 2026-03-12 4/200 2026-03-13 16:04 by ruiyingmiao
[考研] 307求调剂 +5 超级伊昂大王 2026-03-12 5/250 2026-03-13 15:56 by 棒棒球手
[考研] 一志愿山大07化学 332分 四六级已过 本科山东双非 求调剂！ +3 不想理你 2026-03-12 3/150 2026-03-13 14:18 by JourneyLucky
[考研] 321求调剂（食品/专硕） +3 xc321 2026-03-12 6/300 2026-03-13 08:45 by xc321
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭