【求助/交流】单酶切酶和DNA的比例，体系大小的问题 - 分子生物 - 综合其他

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空谷幽风

金虫 (正式写手)

MolEPI: 32
应助: 13 (小学生)
贵宾: 0.05
金币: 1106.1
散金: 500
红花: 13
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在线: 116.5小时
虫号: 714271
注册: 2009-03-04
性别: GG
专业: 生物大分子结构与功能

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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+5, EPI+1): 最近很给力啊！ 2011-04-14 12:06:23

引用回帖:

Originally posted by starfishfly at 2011-04-14 10:58:50:
酶切体系是越大越好吗？
为什么我用EcoR I酶切，20ul体系加0.5ul酶的时候效果比200ul体系加2ul酶效果好？
而且昨天用200ul体系切10ul的DNA没有切5ulDNA效果好

1.关于酶切体系：适当增加酶切体系是好的，因为限制性内切酶只有在自己的最适环境里才能完全发挥它的酶切能力，那么这个环境是由buffer来提供的，适当增大酶切体系可以减少因为移液枪精度或是个人操作所引起的实验误差，有利于限制性内切酶发挥其最大的酶切活性，但是由于增加酶切体系所随之带来的问题是限制性内切酶在体系当中浓度的降低，使得酶与酶切位点结合的几率也会有一定的下降；所以并非体系越大越好
2.关于酶切体系的确定：酶的用量是由底物的量来确定的，一般来讲1ul酶可以切割1ug的底物（最适条件下，1h）；由酶的量来确定酶切体系的大小，一般1ul酶对应20ul的酶切体系；由酶切体系确定buffer和水的量
3.关于根据酶的用量来确定酶切体系：酶切体系的确立是为了给酶提供一个最适的反应环境。酶都是保存在甘油里的（50%），而较高的甘油浓度对任何限制性内切酶的特异性切割都是不利的（产生星活性），正常情况下把酶稀释10倍后就可以忽略此因素的影响，再结合前面提到的适当增大酶切体系的原则，经过实践证明1ul酶对应20ul的酶切体系是个不错的选择