| 查看: 3313 | 回复: 14 | |||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
【求助/交流】单酶切酶和DNA的比例，体系大小的问题已有5人参与
|
|||
|
酶切体系是越大越好吗？ 为什么我用EcoR I酶切，20ul体系加0.5ul酶的时候效果比200ul体系加2ul酶效果好？ 而且昨天用200ul体系切10ul的DNA没有切5ulDNA效果好 |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有182人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
EcoRI 酶切细菌基因组切不开
已经有19人回复- 环形质粒酶切电泳图分析求解
已经有25人回复
- DNA双酶切后在两端加adapter的连接问题
已经有7人回复
- PCR ， 双酶切，连接问题
已经有17人回复
- 连接体系的确定
已经有19人回复
- HindIII酶切基因组DNA
已经有4人回复
- 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点
已经有52人回复
- 请教关于宝公司pMD18T连接问题
已经有4人回复
- 【求助/交流】细菌基因组的单酶切问题
已经有4人回复
- 【求助/交流】双酶切切不动
已经有21人回复
- 【求助/交流】帮我看一下质粒单双酶切图！
已经有29人回复
- 【求助/交流】酶切问题求助！！！
已经有13人回复
- 【分享】DNA重组实验中的部分技术
已经有159人回复
5楼2011-04-14 11:49:52
ben1147
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 18 (小学生)
- 贵宾: 0.003
- 金币: 5847.6
- 红花: 6
- 帖子: 952
- 在线: 116.9小时
- 虫号: 709538
- 注册: 2009-02-26
- 专业: 微生物生理与生物化学
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+6): good 2011-04-14 13:56:58
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+6): good 2011-04-14 13:56:58
|
看你说的效果是指什么了，切割速度？切割是否完全？ 一方面，酶切也是化学反应，反应速度当然跟底物浓度相关，而且酶在稀溶液里的稳定性要差，过于稀的话可以考虑加点BSA。 另一方面，DNA纯度也影响切割，一般小提的质粒纯度都很差的，体系大一些相对好 另外EcoR I本身也比较特殊，酶多了不好 不过一般体系大小影响不会很明显，基本上是个人习惯。有的人就习惯用10 uL的小体系，我就不习惯用50 uL以下的体系。在样品、酶质量都好的情况下基本也不会出问题 |
2楼2011-04-14 11:05:30
空谷幽风
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 32
- 应助: 13 (小学生)
- 贵宾: 0.05
- 金币: 1106.1
- 散金: 500
- 红花: 13
- 帖子: 615
- 在线: 116.5小时
- 虫号: 714271
- 注册: 2009-03-04
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+5, EPI+1): 最近很给力啊！ 2011-04-14 12:06:23
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+5, EPI+1): 最近很给力啊！ 2011-04-14 12:06:23
|
1.关于酶切体系：适当增加酶切体系是好的，因为限制性内切酶只有在自己的最适环境里才能完全发挥它的酶切能力，那么这个环境是由buffer来提供的，适当增大酶切体系可以减少因为移液枪精度或是个人操作所引起的实验误差，有利于限制性内切酶发挥其最大的酶切活性，但是由于增加酶切体系所随之带来的问题是限制性内切酶在体系当中浓度的降低，使得酶与酶切位点结合的几率也会有一定的下降；所以并非体系越大越好 2.关于酶切体系的确定：酶的用量是由底物的量来确定的，一般来讲1ul酶可以切割1ug的底物（最适条件下，1h）；由酶的量来确定酶切体系的大小，一般1ul酶对应20ul的酶切体系；由酶切体系确定buffer和水的量 3.关于根据酶的用量来确定酶切体系：酶切体系的确立是为了给酶提供一个最适的反应环境。酶都是保存在甘油里的（50%），而较高的甘油浓度对任何限制性内切酶的特异性切割都是不利的（产生星活性），正常情况下把酶稀释10倍后就可以忽略此因素的影响，再结合前面提到的适当增大酶切体系的原则，经过实践证明1ul酶对应20ul的酶切体系是个不错的选择 |
3楼2011-04-14 11:18:58
4楼2011-04-14 11:45:25