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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切问题
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)

[求助] 酶切问题

本人前期已近在T载体（买的由PUC18改造而成的）引入带有EcoRI和NcoI的目的片段，现在需再往上连片段。用EcoRI和NcoI双酶切之前构建好的T载体，电泳发现没有条带。接着我在体系中不加酶，加同样的buffer对照,电泳发现也没有条带。可以用同样的EcoRI和NcoI酶和buffer酶切pcr我要连接上的目的片段可以很好酶切。酶切质粒的量是足够的，5道中只上5ul质粒可以见条。双酶切是20ul质粒，3ulbuffer,1ul EcoRI,1ulNcoI,30ul体系。电泳时两个酶切体系60ul在一个孔道里电泳的，不见条带。如果说是buffer降解我的质粒，可是酶切pcr产物却未有问题。如果说没有切开，电泳应该有条带。
求高人指点。
图片说明： 从左往右，第2道1Kb marker,第3道双酶切T载体；第四道不加酶的对照；第5道原始T质粒；第六道空；第7道D2000marker;第8道pcr目的片段；第9道双酶切pcr目的片段

从左往右，第2道1Kb marker,第3道双酶切T载体；第四道不加酶的对照；第5道原始T质粒；第六道空；第7道D2000marker;第8道pcr目的片段；第9道双酶切pcr目的片段

[ Last edited by 1949stone on 2012-3-17 at 12:00 ]
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1楼2012-03-16 21:56:49
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sunwei57

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-03-17 09:32:39
wcx蜗牛: 金币+2, ★有帮助 2012-03-17 09:39:21
建议重新转化你的含目的地片段的质粒重新提取质粒酶切,如果第3道双酶切T载体；第四道不加酶的对照都出自第5道原始T质粒估计很难解释,有可能胶孔漏了,重复一次可能就OK了
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2楼2012-03-17 00:08:02
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sunwei57 at 2012-03-17 00:08:02:
建议重新转化你的含目的地片段的质粒重新提取质粒酶切,如果第3道双酶切T载体；第四道不加酶的对照都出自第5道原始T质粒估计很难解释,有可能胶孔漏了,重复一次可能就OK了

谢谢你的回复，我重复过，几次都是这种情况，胶孔应该不会漏。
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3楼2012-03-17 09:40:23
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sunwei57

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
wcx蜗牛: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-03-17 11:39:02
电泳时间太长了了,最大的可能你上样量太多样品中的RNA 把胶中的EB全部结合,你染色应该能看到条带,酶切用20ul质粒很难切开太多了,我最多用2-3ul质粒(碱裂解法提取),电泳30-40分钟看看
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4楼2012-03-17 11:29:13
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sunwei57 at 2012-03-17 11:29:13:
电泳时间太长了了,最大的可能你上样量太多样品中的RNA 把胶中的EB全部结合,你染色应该能看到条带,酶切用20ul质粒很难切开太多了,我最多用2-3ul质粒(碱裂解法提取),电泳30-40分钟看看

我质粒浓度只有50ng/ul,浓度太低，故上样较多。
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5楼2012-03-17 11:38:51
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sunwei57 at 2012-03-17 11:29:13:
电泳时间太长了了,最大的可能你上样量太多样品中的RNA 把胶中的EB全部结合,你染色应该能看到条带,酶切用20ul质粒很难切开太多了,我最多用2-3ul质粒(碱裂解法提取),电泳30-40分钟看看

我EB不是加在胶中，是电泳完在用EB泡的，故应给不会出现RNA把胶中EB全部结合了。
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6楼2012-03-17 16:00:35
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sunwei57

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
wcx蜗牛: 金币+1 2012-03-19 09:57:08
点20ul质粒,溴酚兰出点样孔就看胶(5分钟左右),看看会有什么情况
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7楼2012-03-17 17:01:30
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王雨云

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wcx蜗牛: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2012-03-20 09:32:14
感觉从你的图中反应你先前构建的载体未成功。要不就是构建好的载体质粒都未提取出来，要不然3，4泳道怎么什么都没有。目的片段中是否含有其它两个常见的酶切位点，先把你认为构建好的载体提质粒，再用其它两个酶来切切看，可以看酶本身有木有问题，同时也可以看你的质粒中到底有木有你以前连接上去的片段。泳道里什么都没有，我觉得最大的可能还是压根儿都没提出质粒。些许拙见，仅供参考
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8楼2012-03-19 15:12:55
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 王雨云 at 2012-03-19 15:12:55:
感觉从你的图中反应你先前构建的载体未成功。要不就是构建好的载体质粒都未提取出来，要不然3，4泳道怎么什么都没有。目的片段中是否含有其它两个常见的酶切位点，先把你认为构建好的载体提质粒，再用其它两个酶来 ...

谢谢你的回复，问题的原因已近找到，正如同你所说，是我提得质粒浓度太低，经过酶切稀释后，电泳就没有了。
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9楼2012-03-20 09:29:11
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王雨云

金虫 (小有名气)
★ ★
西瓜: 金币+2, 没错，实验就要一步一步来~欢迎常来哈^_^ 2012-03-20 12:05:34
做实验就是这样，一点点小问题就可能影响很大，特别是平常看似做了很多遍的实验，总觉得不会出什么错误，其实不然。以前我们好多同学提完质粒都不检测质粒是否提出来了，浓度是否足够的，这样很容易给后续试验带来麻烦的，实验一旦出问题然后再去找原因就难了，一个结果可能是N种原因导致的，太痛苦了。虽然不干本行了，但还是偶尔上论坛看看有没有什么可帮忙的，工作中没能利用本专业知识，在论坛里发挥点余热，
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wcx蜗牛
10楼2012-03-20 11:12:27
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