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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)

[交流] 3‘RACE inner PCR 电泳结果总是有弥散现象回收条带不成带状什么原因啊？ 已有11人参与

采用65度退火温度跑两轮3‘RACE PCR 电泳条带多条，并且最大的条带上面很大的弥散带，用的是TAKARA 3‘RACE试剂盒，设计两条上游特异性引物相差117bp,设计原则按照说明书来的，想问问做过3‘RACE的前辈们，这到底什么原因啊？图1为pcr结果，图2为切胶回收结果。
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1楼 2011-09-09 09:10:34
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by zheng20089829 at 2011-09-09 17:28:54:
我用的是clonetech的盒子，用梯度降低退火温度试试（touch down）弥散我觉得问题也不大，你那个带还可以的，直接割胶去测序好了
[ Last edited by wanhscn on 2011-9-9 at 18:03 ]

你觉得他挖带回收的那个带是不是很弱？还不如PCR产物直接过柱后拿去测序？
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真相是最大的奢侈品
7楼2011-09-09 18:06:07
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linqin1029

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wanhscn(金币+3): Good！ 2011-09-09 16:33:02
怎么，我看不了你的图片啊！ 我提几点建议吧！
1、3‘RACE 的引物一般在60度以上，而且两条引物TM值要相差几度。以便改变两轮PCR的退火温度。
2、两轮巢式PCR的退火温度也要有差异，第二轮PCR退火温度要比第一轮高。以便减少非特异性扩增。
3、第一轮的PCR循环数25轮就OK拉，以便减少非特异扩增。
4、第一轮PCR的产物一般稀释5~20倍作为第二轮PCR的模板，以便减少非特异的产物模板。
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2楼2011-09-09 10:00:52
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taigongzaici

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
换盒子－－－ｃｌｏｔｈｔｅｃｈ，用过的都说好
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3楼2011-09-09 14:55:33
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)
dhd997: 引用回复，他会看到你的提问的 2011-09-10 07:49:30
谢谢前辈的回答！提取的总RNA 中有基因组DNA 污染会造成这样的结果吗？
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4楼2011-09-09 16:07:14
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