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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)

[交流] 3‘RACE inner PCR 电泳结果总是有弥散现象回收条带不成带状什么原因啊? 已有11人参与

采用65度退火温度跑两轮3‘RACE PCR 电泳条带多条,并且最大的条带上面很大的弥散带,用的是TAKARA 3‘RACE试剂盒,设计两条上游特异性引物相差117bp,设计原则按照说明书来的,想问问做过3‘RACE的前辈们,这到底什么原因啊?图1为pcr结果,图2为切胶回收结果。


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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)

前一次切胶回收后转化链接,做的菌落PCR用的引物还是第二次PCR的引物,可是结果出来都是比较小的片段,直接送去菌液测序结果为没有信号,所以我就认为是切胶回收的带像是弥散而不是单一带了,没有信号是浓度太小还是用引物也没有测序出结果呢?
9楼2011-09-09 22:14:50
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linqin1029

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
wanhscn(金币+3): Good! 2011-09-09 16:33:02
怎么,我看不了你的图片啊! 我提几点建议吧!
1、3‘RACE 的引物一般在60度以上,而且两条引物TM值要相差几度。以便改变两轮PCR的退火温度。
2、两轮巢式PCR的退火温度也要有差异,第二轮PCR退火温度要比第一轮高。以便减少非特异性扩增。
3、第一轮的PCR循环数25轮就OK拉,以便减少非特异扩增。
4、第一轮PCR的产物一般稀释5~20倍作为第二轮PCR的模板,以便减少非特异的产物模板。
2楼2011-09-09 10:00:52
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taigongzaici

新虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
换盒子---clothtech,用过的都说好
3楼2011-09-09 14:55:33
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)

dhd997: 引用回复,他会看到你的提问的 2011-09-10 07:49:30
谢谢前辈的回答!提取的总RNA 中有基因组DNA 污染会造成这样的结果吗?
4楼2011-09-09 16:07:14
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