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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 3‘RACE inner PCR 电泳结果总是有弥散现象回收条带不成带状什么原因啊？
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)

[交流] 3‘RACE inner PCR 电泳结果总是有弥散现象回收条带不成带状什么原因啊？ 已有11人参与

采用65度退火温度跑两轮3‘RACE PCR 电泳条带多条，并且最大的条带上面很大的弥散带，用的是TAKARA 3‘RACE试剂盒，设计两条上游特异性引物相差117bp,设计原则按照说明书来的，想问问做过3‘RACE的前辈们，这到底什么原因啊？图1为pcr结果，图2为切胶回收结果。
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1楼 2011-09-09 09:10:34
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)
前一次切胶回收后转化链接，做的菌落PCR用的引物还是第二次PCR的引物，可是结果出来都是比较小的片段，直接送去菌液测序结果为没有信号，所以我就认为是切胶回收的带像是弥散而不是单一带了，没有信号是浓度太小还是用引物也没有测序出结果呢？
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9楼2011-09-09 22:14:50
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linqin1029

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wanhscn(金币+3): Good！ 2011-09-09 16:33:02
怎么，我看不了你的图片啊！ 我提几点建议吧！
1、3‘RACE 的引物一般在60度以上，而且两条引物TM值要相差几度。以便改变两轮PCR的退火温度。
2、两轮巢式PCR的退火温度也要有差异，第二轮PCR退火温度要比第一轮高。以便减少非特异性扩增。
3、第一轮的PCR循环数25轮就OK拉，以便减少非特异扩增。
4、第一轮PCR的产物一般稀释5~20倍作为第二轮PCR的模板，以便减少非特异的产物模板。
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2楼2011-09-09 10:00:52
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taigongzaici

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
换盒子－－－ｃｌｏｔｈｔｅｃｈ，用过的都说好
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3楼2011-09-09 14:55:33
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)
dhd997: 引用回复，他会看到你的提问的 2011-09-10 07:49:30
谢谢前辈的回答！提取的总RNA 中有基因组DNA 污染会造成这样的结果吗？
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4楼2011-09-09 16:07:14
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