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兄弟姐妹们来帮我看下根据这几个线索能否确定一个pcr产物是否为我要的片段
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最近在做RACE，根据保守序列设计了巢式引物A和B，与试剂盒带的UPM和NUP进行巢式pcr，pcr程序设计的降落pcr。第一次pcr以引物A和UPM扩增，电泳检测无结果，以B和NUP进行巢式扩增，出来两条带，一条520左右，一条425。让生工克隆测序，520这条带上，找不到我的两对引物，作为3'末端，也没有polyA尾巴。（1）而425的这个片段，能找的我的两对引物B和NUP，且在序列两端，（2）该片段有polyA尾巴，（3）而且和我得保守序列有160bp的100%的重叠，再设计引物时，理论上就是160bp的重叠，该特征符合。（4）再设计引物时，B和NUP之间没有引物二聚体，引物B评分100。（5）pcr用的生工的MIX，所以具体的tap酶啊，Mg离子的浓度都不清楚。但是在对这段基因进行blast的时候，没有任何的相似结果，所以很纠结，根据上面的五个线索，该片段是否是我要的目的片段，又会不会是扩出来的非特异性条带，我很不明白为什么会出现非特异性。附上3‘RACE的pcr图。 3race ifn-1-5-18.jpg |
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2楼2014-05-28 11:26:01
