应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 3'RACE做了几次，为什么老是这样子，大家看一下帮帮忙吧，苦闷死了！~
111/2返回列表12下一页
查看: 2040  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

songxiaobop

金虫 (小有名气)

[求助] 3'RACE做了几次，为什么老是这样子，大家看一下帮帮忙吧，苦闷死了！~

用的是TAKARA的盒子
这个是做巢式PCR的第一轮扩增，似乎是又一条带，然后就按照说明书的要求，取1微升做了第二轮扩增，结果是这个样子。

然后几次做的都是下边这样的：

反转录体系中要求RNA的量是1微克，可是我感觉自己提的RNA浓度比较低，反转录体系是10微升的，怎样保证反转录的效果，怎样检测？
巢式扩增是不是按照说明书上的50微升体系比较好？
这样的结果应该怎样调整一下体系？
快毕业了，很是着急苦闷啊 。
求大家帮帮忙！










[ 来自科研家族 深海家族 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-12-06 09:13:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wjm0403

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！whs 2011-12-07 11:43:58
songxiaobop(金币+2): 2011-12-19 08:42:46
最好是每做一步都做检测，提取RNA后检测RNA的完整性，如果质量不好，RACE很难出结果。一般来说3RACE相对容易做，建议多设计几条RACE引物，一般来说扩增出来的条带全部回收后测序（一条带很可能不是我们感兴趣的），当然大部分是无用的序列，可能只有十分之一二才是目的序列。做RACE是个很熬人的活，我最近做了7个基因的RACE,设计了50多条RACE引物，做了三四轮RACE,回收片段多达120多个，全部做了TA克隆，测序不下200个样，到目前为止6个基因是扩增到全长了，其中一个还是没有拿到目的片段，打算放弃了。做RACE是个体力活，依个人经验来看，回收一两个片段就能得到感兴趣的基因是不可能的。
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2011-12-06 23:43:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): good 2011-12-08 18:47:02
songxiaobop(金币+3): 2011-12-19 08:42:52
做race,特别是5端,用nested引物最保险,不然拿到的很多非特异性扩增条带~~
3'就容易多了,一般的PCR酶,takara的LA可以试试,虽然保真性不好,但扩增效率还不错
赞一下(2人) 回复此楼
5楼2011-12-07 10:00:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

zcy1214

木虫 (著名写手)

普通青年

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-12-06 20:05:47
songxiaobop(金币+2): 2011-12-19 08:42:38
压根就没带，是不是你反转录有问题的嗯，
我也是新手，我虽然有条带，但不是我要的，呜呜
一起努力哈
赞一下(1人) 回复此楼
达则兼济天下，穷则独善其身
2楼2011-12-06 18:27:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

songxiaobop

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zcy1214 at 2011-12-06 18:27:48:
压根就没带，是不是你反转录有问题的嗯，
我也是新手，我虽然有条带，但不是我要的，呜呜
一起努力哈

我也怀疑是我的反转录有问题，RNA提的到是还行，就是浓度有点低。
赞一下 回复此楼
3楼2011-12-06 22:10:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

纳兰欣光

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wjm0403 at 2011-12-06 23:43:19:
最好是每做一步都做检测，提取RNA后检测RNA的完整性，如果质量不好，RACE很难出结果。一般来说3RACE相对容易做，建议多设计几条RACE引物，一般来说扩增出来的条带全部回收后测序（一条带很可能不是我们感兴趣的） ...

想问一下全长引物的设计是怎样设计的啊？
有什么需要注意的吗？
赞一下 回复此楼
6楼2011-12-07 10:19:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

纳兰欣光

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
1楼: Originally posted by songxiaobop at 2011-12-06 09:13:05:
用的是TAKARA的盒子
这个是做巢式PCR的第一轮扩增，似乎是又一条带，然后就按照说明书的要求，取1微升做了第二轮扩增，结果是这个样 ...

第二轮PCR提高退火温度1-2度，循环数也加大一点试试
赞一下 回复此楼
7楼2011-12-07 10:20:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

songxiaobop

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by shaquila at 2011-12-07 10:00:36:
做race,特别是5端,用nested引物最保险,不然拿到的很多非特异性扩增条带~~
3'就容易多了,一般的PCR酶,takara的LA可以试试,虽然保真性不好,但扩增效率还不错

请教一下：试剂盒里给的反转录体系是10微升的，可是我的RNA浓度比较低，还要求TotalRNA的量是1微克。体系是：RNAX微升；3‘RACEAdaptor 1ul；5xM-MLV Buffer 2ul;dNTP 1ul;Rnase Inhibitor 0.25 ul；酶0.25ul；Rnase Free water5.5-Xul。 这个怎么办呢,高手？
赞一下 回复此楼
8楼2011-12-07 10:58:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zcy1214

木虫 (著名写手)

普通青年

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): Good！可以跑actin等内参基因。 2011-12-08 18:47:40
引用回帖:
3楼: Originally posted by songxiaobop at 2011-12-06 22:10:46:
我也怀疑是我的反转录有问题，RNA提的到是还行，就是浓度有点低。

那就把反转录的跑个PCR检测下哈
赞一下(1人) 回复此楼
达则兼济天下，穷则独善其身
9楼2011-12-07 22:28:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

忘忧草_

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

songxiaobop(金币+3): 2011-12-19 08:43:10
个人感觉，在模板没问题的前提下，退火温度比较关键，比一般的pcr要稍高，第二次pcr适当增加循环数。
赞一下 回复此楼
不将就
10楼2011-12-08 22:22:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 songxiaobop 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 085410 273求调剂 +9 X1999 2026-04-09 9/450 2026-04-12 00:46 by 丛麟ll
[考研] 一志愿厦大0856，306求调剂 +15 Bblinging 2026-04-11 15/750 2026-04-11 22:53 by 314126402
[考研] 求调剂 +13 张番茄不炒蛋 2026-04-10 14/700 2026-04-11 16:02 by vgtyfty
[基金申请] 山东省基金2026 +4 jerry681 2026-04-08 5/250 2026-04-11 13:59 by laobibibi
[考研] 347求调剂 +3 mhyqyy 2026-04-06 3/150 2026-04-11 12:19 by zhq0425
[考研] 295分求调剂 +9 ?要上岸? 2026-04-10 9/450 2026-04-11 10:48 by qingpingzhu
[考研] 22408 352分求调剂 +4 努力的夏末 2026-04-09 4/200 2026-04-11 10:42 by maddjdld
[考研] 机械专硕270求调剂，接受跨专业 +12 老师看看我吧aba 2026-04-09 14/700 2026-04-11 10:21 by laoshidan
[考研] 材料与化工调剂 +12 否极泰来2026 2026-04-10 13/650 2026-04-11 00:28 by wangjihu
[材料工程] 材料调剂推荐 +8 蛋糕x2 2026-04-07 8/400 2026-04-10 23:13 by Ftglcn90
[考研] 273求调剂 +51 麦小叮当 2026-04-06 58/2900 2026-04-10 15:54 by jiajinhpu
[考研] 282，电气工程专业，求调剂，不挑专业 +9 jggshjkkm 2026-04-10 9/450 2026-04-10 14:55 by 逆水乘风
[考研] 296求调剂 +6 汪！？！ 2026-04-08 6/300 2026-04-10 11:02 by mattzhming
[考研] 考研调剂 +13 冰冰，，， 2026-04-07 13/650 2026-04-09 17:01 by Lilly_Li
[考博] 材料方向考博，求推荐 +3 言语aaa 2026-04-05 4/200 2026-04-08 22:22 by nxgogo
[考研] 266调剂 +8 daya sun 2026-04-07 9/450 2026-04-08 20:27 by yutian743
[考研] 求调剂 +11 wwwwabcde 2026-04-07 11/550 2026-04-07 23:16 by JourneyLucky
[考研] 机械调剂 +3 zzzbcb 2026-04-07 3/150 2026-04-07 22:19 by hemengdong
[考研] 315求调剂 +5 ＆123456789 2026-04-05 5/250 2026-04-05 19:55 by nepu_uu
[考研] 296求调剂 +3 汪！？！ 2026-04-05 5/250 2026-04-05 17:38 by 蓝云思雨
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭