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怀西扬

新虫 (初入文坛)

[求助] 3‘race相同操作,结果无法重复

我根据得到的200多bp的序列设计了3'race 外引物GSP(Tm:73.8度)和内引物NGSP(Tm:77.6度),
用的Takara的3'race试剂盒。 outter PCR和inner PCR设的退火温度都是55度,循环数都是30。当时得到下面的结果:
切胶回收时没回收到条带。我重做了好几次,同样的操作,却再也重复不到这个结果了。
3'race试剂盒上推荐的退火温度55度,但可根据实际情况在37——65度范围内调整。我就想是不是我设计的引物Tm太高,进行PCR时退火温度却只有55度,结合不上去。
于是重新设计了引物,这次外引物Tm:54度,内引物Tm:61度,但是进行了多次温度梯度:43度——58度,得到的却是下面的结果:
所有条带均在Marker的100bp上面一点点的地方。(这张图Marker没跑开,我后来重跑,看见很淡的条带在在Marker的100bp上面一点点的地方。)
请各位同仁帮我看一下可能是什么原因造成我的结果无法重复?后来重新设计引物却P不出来的原因是什么呢?



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