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3‘race相同操作，结果无法重复
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我根据得到的200多bp的序列设计了3'race 外引物GSP（Tm:73.8度）和内引物NGSP（Tm:77.6度）， 用的Takara的3'race试剂盒。 outter PCR和inner PCR设的退火温度都是55度，循环数都是30。当时得到下面的结果：  切胶回收时没回收到条带。我重做了好几次，同样的操作，却再也重复不到这个结果了。 3'race试剂盒上推荐的退火温度55度，但可根据实际情况在37——65度范围内调整。我就想是不是我设计的引物Tm太高，进行PCR时退火温度却只有55度，结合不上去。 于是重新设计了引物，这次外引物Tm:54度,内引物Tm:61度，但是进行了多次温度梯度：43度——58度，得到的却是下面的结果：  所有条带均在Marker的100bp上面一点点的地方。(这张图Marker没跑开，我后来重跑，看见很淡的条带在在Marker的100bp上面一点点的地方。) 请各位同仁帮我看一下可能是什么原因造成我的结果无法重复？后来重新设计引物却P不出来的原因是什么呢？   |
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