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elliott2591

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】用水PCR出1K条带已有4人参与

最近按分子克隆做5‘RACE,结果以cDNA为模板,PCR没有出来条带,反而以水为对照的出来1K条带,求助是什么原因?
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shengwufenzi

金虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+2): 2010-04-24 13:09
1949stone(金币+2):谢谢交流 2010-04-24 13:22
elliott2591(金币+1): 2010-04-25 20:21
原因一:对照和目的管弄反了
原因二:对照管污染了且目的管选择体系及程序不合理
原因三:目的管忘记加酶,对照管中出现引物自连。
2楼2010-04-24 13:05:35
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elliott2591

金虫 (小有名气)

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引用回帖:
Originally posted by shengwufenzi at 2010-04-24 13:05:35:
原因一:对照和目的管弄反了
原因二:对照管污染了且目的管选择体系及程序不合理
原因三:目的管忘记加酶,对照管中出现引物自连。

1、没有弄反,可以确定
2、污染问题:我换了新的primer,dNTP,Taq,水,还是有带,所以污染可能性不大
3、程序不合理:程序不合理?
4、引物自连:可以连出1k条带吗?且加模板的体系没有条带!
3楼2010-04-24 15:47:26
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

elliott2591(金币+1): 2010-04-25 20:21
楼主做的是什么物种的5RACE?如果是菌的污染就常见了
换了新东西,药品应该没有问题了,水就不好说了,有可能是水污染
还有你说引物换了,5RACE,cDNA接头的引物也换了吗?很有可能是这个引物有问题
4楼2010-04-24 17:08:42
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elliott2591

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-04-24 17:08:42:
楼主做的是什么物种的5RACE?如果是菌的污染就常见了
换了新东西,药品应该没有问题了,水就不好说了,有可能是水污染
还有你说引物换了,5RACE,cDNA接头的引物也换了吗?很有可能是这个引物有问题

我做的是棉花的,水是高压灭菌的,cDNA接头我试了两种,结果都有问题,都有条带,但条带大小不一致。
另外,我设计了5个特异引物,结果,都有条带,只是有条带大小不一致,且非特异,无规律性
5楼2010-04-24 18:54:24
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sdluqun

铁杆木虫 (著名写手)

板砖队长

elliott2591(金币+1): 2010-04-25 20:21
听BioRad工程师说过 阴性对照出现扩增条带是很常见的
建议换一下水吧
尔非我焉知我悲喜
6楼2010-04-24 19:04:46
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elliott2591

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by sdluqun at 2010-04-24 19:04:46:
听BioRad工程师说过 阴性对照出现扩增条带是很常见的
建议换一下水吧

谢谢
7楼2010-04-24 19:18:45
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

elliott2591(金币+1): 2010-04-25 20:21
如果水有污染,高压灭菌是无法解决的,这是水质量的问题
做棉花基因组,按常理说不应该是水污染,应该是什么药品中混有棉花的cDNA或者基因组了
引物更换过,还是污染说明引物没有问题,其他的药品也都换过,这就比较奇怪,是不是之前将棉花的基因导入过质粒呢?
8楼2010-04-24 19:19:24
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elliott2591

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-04-24 19:19:24:
如果水有污染,高压灭菌是无法解决的,这是水质量的问题
做棉花基因组,按常理说不应该是水污染,应该是什么药品中混有棉花的cDNA或者基因组了
引物更换过,还是污染说明引物没有问题,其他的药品也都换过,这就 ...

如果是其他药品中有棉花cDNA污染的话,我是不是可以测序检测一下?
9楼2010-04-24 20:40:37
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