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liuwei78

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】大家帮忙看一张电泳图

这是张单酶切的电泳图。我原来的质粒大小是5700bp左右，预计插入一个817bp的片段。连接转化后挑了六个单菌落，其中有三个菌液PCR有预期结果。然后我就提质粒单酶切。结果竟然都有两三个条带，不知道问题出在哪？而且从条带位置上看，中间一个条带的位置是我预期的6500多bp。求大家帮忙分析下。
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1楼 2011-03-28 10:44:04
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
liuwei78(金币+3): 2011-03-29 09:11:34
能把Maker大小说一下吗？
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2楼2011-03-28 13:12:12
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wzwhq

铁虫 (小有名气)
liuwei78(金币+3): 2011-03-29 09:11:41
可能是你酶切时间短，切不完全导致的吧，6500是你的目的片段，下面的是没有切开的质粒，跑得比较快，个人看法，仅供参考。
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3楼2011-03-28 15:20:03
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另一个天堂

金虫 (小有名气)
liuwei78(金币+3): 2011-03-29 09:09:18
是不是酶切时间过短了，你可以参考一下
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4楼2011-03-28 15:23:52
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-03-29 08:42:57
liuwei78(金币+3): 2011-03-29 09:09:07
单酶切验证，你确定你的质粒和插入片段上只有一个此酶切位点吗？我看有三个，不然怎么会切出来三条带呢？
一般做酶切验证是这样子的，把重组质粒用你当初的两个酶进行酶切，然后跑电泳时点上对照（原来酶切的质粒+原来酶切的基因）。
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5楼2011-03-28 15:37:43
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河外生命

木虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): 谢谢交流 2011-03-29 08:43:19
liuwei78(金币+3): 2011-03-29 09:07:53
酶切多长时间，是否产生了环状，线性，缺刻三种形式的DNA
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6楼2011-03-28 21:46:51
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liuwei78

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 河外生命 at 2011-03-28 21:46:51:
酶切多长时间，是否产生了环状，线性，缺刻三种形式的DNA

我酶切了十三个小时左右，提质粒电泳之后的确有三种形式的DNA，其中环状最多。
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7楼2011-03-29 09:07:10
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liuwei78

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 另一个天堂 at 2011-03-28 15:23:52:
是不是酶切时间过短了，你可以参考一下

我切了十三个多小时。
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8楼2011-03-29 09:07:39
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liuwei78

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-03-28 15:37:43:
单酶切验证，你确定你的质粒和插入片段上只有一个此酶切位点吗？我看有三个，不然怎么会切出来三条带呢？
一般做酶切验证是这样子的，把重组质粒用你当初的两个酶进行酶切，然后跑电泳时点上对照（原来酶切的质粒 ...

我用的是当初那个酶酶切的，理论上其他位置上没有这个酶切位点。
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9楼2011-03-29 09:08:52
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liuwei78

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhangxn2010 at 2011-03-28 13:12:12:
能把Maker大小说一下吗？

19329,7743,6223,4254.。。。
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10楼2011-03-29 09:11:11
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另一个天堂

金虫 (小有名气)
liuwei78(金币+5): 2011-03-30 09:43:26
引用回帖:
Originally posted by liuwei78 at 2011-03-29 09:07:10:
我酶切了十三个小时左右，提质粒电泳之后的确有三种形式的DNA，其中环状最多。

那估计是质粒纯度问题，我也遇到过这种情况。是不是在纯化过程中没纯化干净？
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11楼2011-03-29 22:07:20
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傻子

木虫 (正式写手)
酶切不完全吧，不知道其他虫子的酶切如何，我自己做的确实没切完全过，都带有质粒条带，这样的话，就首先包括质粒条带——这里可能包括1-3条带，此外，是酶切后的条带——不定，如需确定条带，你首先需要在酶切前，仔细核对PCR产物和质粒的序列，是否在这些片段中只有单个酶切位点，然后做出预测。这通过DNAMAN这类可以分析下。然后，多重复几次吧
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12楼2011-03-31 10:31:45
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