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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】有关菌液PCR的问题
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bayleaf1987

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】有关菌液PCR的问题 已有13人参与

求助一下版里的各位大虾，这个菌液PCR的结果可靠性有多高？一般菌液PCR大家都是用什么做对照的？我用清水做模板总是会出现和目的条带相同大小的条带，换了新的引物，水，buffer，和酶以后结果还是一样，问了几个同学发现都有相同的问题，希望大家可以帮忙解答一下，如果菌液PCR的结果不可靠的话，我应该如何验证我的表达载体是否转入农杆菌呢？多谢。。
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1楼 2010-05-20 20:51:48
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
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lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-20 21:36:46
清水都出条带，那肯定是试剂或者耗材或者混样的过程中污染了。全套都换，同时用高压灭菌的耗材，戴手套在干净的环境下混样吧
另外，那个条带不是dimer吧
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2楼2010-05-20 21:04:52
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bayleaf1987

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-05-20 21:04:52:
清水都出条带，那肯定是试剂或者耗材或者混样的过程中污染了。全套都换，同时用高压灭菌的耗材，戴手套在干净的环境下混样吧
另外，那个条带不是dimer吧

不是，和目的条带一样的，我把所有的都换了一遍，而且枪头什么都灭了40分钟，操作还特别注意了，结果还是出。。。。哭死了
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3楼2010-05-21 09:46:42
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霖希

★
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操作台操作吧，我们一般是用质粒当模板，没考察过阴性的。
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4楼2010-05-21 13:34:52
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feilr

木虫 (正式写手)
★
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肯定被什么污染了，不然怎么可能出条带呢，你用灭菌超纯水，新换试剂试试呢
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5楼2010-05-21 13:56:58
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miya173

银虫 (小有名气)
★
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实验过程中什么被污染了吧，如果不是dimer那就只能是这个原因了，我们一般都用菌液做pcr，农杆菌的比较难扩。
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6楼2010-05-21 14:14:52
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★
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我也遇到这样的问题,而且扩2kb的时候就出现2kb条带,扩1.5 kb时清水对照就出现1.5kb条带,很迷茫.
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7楼2010-05-21 15:55:35
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骚人追月

金虫 (小有名气)
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lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-22 13:11:02
清水出带的话，肯定是污染了，各种污染，自己摸索下。
最后鉴定一般都是先跑菌液PCR，再测序什么的。不行的话看一看酶切位点，可以通过酶切检测的方法。但是那样的话目的性不强，而且需要的内切酶量较大
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会做饭就会做实验？
8楼2010-05-21 16:49:32
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
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不会是引物的问题吧，使用的是通用引物，还是目的片段本身的引物，如果是目的片段自身的引物，很大可能是引物的问题，如果是通用引物怀疑操作是最大的问题
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9楼2010-05-21 17:21:25
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
★ ★
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lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-22 13:12:05
菌落PCR不能说明实质问题，最好提质粒酶切鉴定一下
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10楼2010-05-21 21:22:59
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