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竹林江南

铜虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】菌落PCR问题

问一下,我想构建16s rRNA基因文库。DNA提取、PCR扩增(引物27f,1492r,产生片段约1500bp)纯化都没有问题,连接载体pMDT19,连接后转化、涂布平板有单克隆出来,但做菌落PCR时最多只有200bp的结果出来,是什么原因呢?
构建另外一个目的基因克隆文库,同样的操作步骤,只是另外一对引物扩增出的是500bp产物,克隆后菌落pcr能够成功。
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犹寒

铁虫 (初入文坛)


竹林江南(金币+1): 2011-01-19 13:45:05
引用回帖:
Originally posted by 竹林江南 at 2011-01-18 15:57:23:
问一下,我想构建16s rRNA基因文库。DNA提取、PCR扩增(引物27f,1492r,产生片段约1500bp)纯化都没有问题,连接载体pMDT19,连接后转化、涂布平板有单克隆出来,但做菌落PCR时最多只有200bp的结果出来,是什么原 ...

我的也出现问题了,克隆出来,也pcr出来了条带,只是测不出序,很是郁闷。另外,引物27f,和1492r是什么引物,通用引物吗?主要p什么菌的?你的菌落PCR是怎么做的呢?有没有非特异性条带出现呢?
2楼2011-01-19 10:20:15
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我叫路人甲

银虫 (小有名气)


你的菌落PCR的引物是什么呢?
3楼2011-01-23 17:41:18
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zgb1982

木虫 (正式写手)


看下头像
4楼2011-01-23 18:35:39
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ureyguo

木虫 (正式写手)


竹林江南(金币+2): 2011-08-18 10:20:12
连接效率的问题,换换连接体系条件试试。
5楼2011-03-03 17:26:43
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kingleo99

木虫 (小有名气)


竹林江南(金币+3): 2011-08-18 10:20:40
你的菌落PCR几乎都是假阳性片段,建议可以使用上下游引物P47和P48,扩增出的是1700bp 包括载体上的200bp。载体自连接估计在200左右。要么是你的连接效率太低,如果是这样那最好别筛了重新转化吧
6楼2011-03-03 18:10:57
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)


竹林江南(金币+2): 2011-08-18 10:21:07
200多 是载体自连。说明转化效率低。 换载体
7楼2011-03-03 19:55:13
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shicaozhu

银虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
T载很少有自连的,可能是16S片段不纯,建议PCR产物切胶回收后再连T载。
8楼2012-04-07 13:38:07
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