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zxyjenny6

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】5500bp的片段PCR问题 已有18人参与

各位大侠:本人最近在做一段5500bp的目的基因的PCR,采用的是takara的EX TAQ酶,选择的引物应该没有问题,按照相关原则设定了反应条件,并且在此基础上稍作改变尝试了几次,但都没有P出来。想请问各位,有没有什么好的建议或者应该怎样改进反应条件,能把我要的目的基因P出来。O(∩_∩)O谢谢!
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yuanfeng

金虫 (小有名气)

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1949stone(金币+2): 2010-04-25 13:12
扩的片段太长了吧,扩长片段我们一般用的是trans的fastpfu,一般20s 1Kb,5.5kb延伸2min应该足够了,而且保真性很好。条件就是一般的条件,我们做过以保存的菌液做模板p4kb的基因,效果很好的。
8楼2010-04-24 21:24:22
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shengwufenzi

金虫 (正式写手)

★ ★ ★
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1949stone(金币+2): 2010-04-25 13:11
你做的片段有些大,肯定不好做的。再有一方法是先扩增此基因的一部分片段,再酶切后做反向PCR,不过难度也是挺大的,实在不行,你可以试试
2楼2010-04-24 16:22:48
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gastrodia

金虫 (正式写手)

★ ★
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1949stone(金币+1): 2010-04-25 13:11
扩增长片段的时候,你的模板一定要纯,
3楼2010-04-24 16:52:30
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

★ ★
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1949stone(金币+1): 2010-04-25 13:11
设计的引物稍长点 循环次数减短
仕不可不弘毅,任重而道远
4楼2010-04-24 16:52:38
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