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congyunxy

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】长片段PCR已有7人参与

现在正在扩增一个长约2800左右的基因,大家有什么好的建议吗?我是要构建这个基因的真核表达载体,所以不能有突变的位点。

[ Last edited by congyunxy on 2011-1-10 at 13:21 ]
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):鼓励交流 2011-01-08 12:18:31
2.8 kb不长哦,probest就能扩出来。
Thank-you,so-blue.
2楼2011-01-08 12:16:21
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HO-1

木虫 (小有名气)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
最爱花诗雨(金币+1):欢迎热心的虫虫 2011-01-08 15:55:16
用TAKARA的LA Taq酶,我觉得挺好用的!
3楼2011-01-08 14:59:30
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zx1984

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
就是延伸的时候,时间要长一些
4楼2011-01-08 15:16:12
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congyunxy

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by HO-1 at 2011-01-08 14:59:30:
用TAKARA的LA Taq酶,我觉得挺好用的!

现在我就用的这个酶,但是非特异性扩增很多。用primer5设计引物,满足条件的引物不多,于是在引物中修改了几个碱基为了使上下游引物Tm值相近(引物是在起始密码子之前和终止密码子之后设计的)。能扩出目的片段,由于杂带多,于是以扩出来目的带的那一管PCR产物为模板,但是非特异性的带出来了,特异性的带没了。
5楼2011-01-08 15:49:04
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HO-1

木虫 (小有名气)

★ ★
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rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~~ 2011-01-08 22:41:46
引用回帖:
Originally posted by congyunxy at 2011-01-08 15:49:04:

现在我就用的这个酶,但是非特异性扩增很多。用primer5设计引物,满足条件的引物不多,于是在引物中修改了几个碱基为了使上下游引物Tm值相近(引物是在起始密码子之前和终止密码子之后设计的)。能扩出目的片段 ...

可以将目的条带切下来,作为模板再行PCR!
6楼2011-01-08 22:07:05
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congyunxy

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by HO-1 at 2011-01-08 22:07:05:


可以将目的条带切下来,作为模板再行PCR!

太淡了,可能会回收不出来。准备在这个温度下多扩几管再回收。谢谢你的回答。
7楼2011-01-08 22:16:36
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by congyunxy at 2011-01-08 15:49:04:

现在我就用的这个酶,但是非特异性扩增很多。用primer5设计引物,满足条件的引物不多,于是在引物中修改了几个碱基为了使上下游引物Tm值相近(引物是在起始密码子之前和终止密码子之后设计的)。能扩出目的片段 ...

退火温度适当高个1-2度,应该不是太难
一直向前!
8楼2011-01-08 22:21:22
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)

2.8k  用la 奢侈

ex 足够了
9楼2011-01-08 22:57:53
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congyunxy

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by zhangxn2010 at 2011-01-08 22:21:22:

退火温度适当高个1-2度,应该不是太难

谢谢你的回答,那我把退火温度提高一点再试一下。
10楼2011-01-09 14:37:07
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