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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】长片段PCR
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congyunxy

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】长片段PCR 已有7人参与

现在正在扩增一个长约2800左右的基因，大家有什么好的建议吗？我是要构建这个基因的真核表达载体，所以不能有突变的位点。

[ Last edited by congyunxy on 2011-1-10 at 13:21 ]
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1楼 2011-01-08 11:34:26
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):鼓励交流 2011-01-08 12:18:31
2.8 kb不长哦，probest就能扩出来。
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Thank-you，so-blue.
2楼2011-01-08 12:16:21
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HO-1

木虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
最爱花诗雨(金币+1):欢迎热心的虫虫 2011-01-08 15:55:16
用TAKARA的LA Taq酶，我觉得挺好用的！
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3楼2011-01-08 14:59:30
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zx1984

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
就是延伸的时候，时间要长一些
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4楼2011-01-08 15:16:12
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congyunxy

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by HO-1 at 2011-01-08 14:59:30:
用TAKARA的LA Taq酶，我觉得挺好用的！

现在我就用的这个酶，但是非特异性扩增很多。用primer5设计引物，满足条件的引物不多，于是在引物中修改了几个碱基为了使上下游引物Tm值相近（引物是在起始密码子之前和终止密码子之后设计的）。能扩出目的片段，由于杂带多，于是以扩出来目的带的那一管PCR产物为模板，但是非特异性的带出来了，特异性的带没了。
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5楼2011-01-08 15:49:04
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HO-1

木虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~~ 2011-01-08 22:41:46
引用回帖:
Originally posted by congyunxy at 2011-01-08 15:49:04:

现在我就用的这个酶，但是非特异性扩增很多。用primer5设计引物，满足条件的引物不多，于是在引物中修改了几个碱基为了使上下游引物Tm值相近（引物是在起始密码子之前和终止密码子之后设计的）。能扩出目的片段 ...

可以将目的条带切下来，作为模板再行PCR!
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6楼2011-01-08 22:07:05
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congyunxy

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by HO-1 at 2011-01-08 22:07:05:


可以将目的条带切下来，作为模板再行PCR!

太淡了，可能会回收不出来。准备在这个温度下多扩几管再回收。谢谢你的回答。
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7楼2011-01-08 22:16:36
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by congyunxy at 2011-01-08 15:49:04:

现在我就用的这个酶，但是非特异性扩增很多。用primer5设计引物，满足条件的引物不多，于是在引物中修改了几个碱基为了使上下游引物Tm值相近（引物是在起始密码子之前和终止密码子之后设计的）。能扩出目的片段 ...

退火温度适当高个1-2度，应该不是太难
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一直向前！
8楼2011-01-08 22:21:22
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
2.8k  用la 奢侈

ex 足够了
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9楼2011-01-08 22:57:53
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congyunxy

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zhangxn2010 at 2011-01-08 22:21:22:

退火温度适当高个1-2度，应该不是太难

谢谢你的回答，那我把退火温度提高一点再试一下。
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10楼2011-01-09 14:37:07
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