应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】菌落PCR扩出来的片段不是目的片段，咋办啊？？？？
101/1返回列表
查看: 2328  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

梦想起飞

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】菌落PCR扩出来的片段不是目的片段，咋办啊？？？？ 已有6人参与

今天两次菌落PCR，扩出来的片段都不是目的片段。最初P的是菌的16S，用的是通用引物27F和1492R，扩出来1500bp左右的16S片段，然后将PCR产物切胶回收纯化，并且已检测了回收产物，是1500左右。然后做连接，连接到pMD19—T载体上，转化JM109感受态，次日，平板上长出菌落，白斑居多，蓝斑数个，挑取白斑做菌落PCR，引物用M13，电泳检测PCR产物，条带居然在500bP处！！！吓我一跳！我做了两次了，两次一共挑了19个白斑了，扩出来都是500bp的。怎么回事啊这是？？？？？请大侠们解释一下。感激涕零！！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2010-12-14 21:02:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

waiwaidou_1983

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
rainwander(金币+5):鼓励积极参与~~~ 2010-12-14 22:25:24
大肠杆菌中也有16S，你的引物可能扩出的是宿主菌的16S， 不是你插入的目的片段
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2010-12-14 21:15:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

梦想起飞

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by waiwaidou_1983 at 2010-12-14 21:15:54:
大肠杆菌中也有16S，你的引物可能扩出的是宿主菌的16S， 不是你插入的目的片段

可我用的是M13引物啊，这不是针对载体的吗？怎么会扩出大肠杆菌的基因？
赞一下 回复此楼
3楼2010-12-14 21:54:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+2):谢谢交流 2010-12-17 11:14:29
引用回帖:
Originally posted by 梦想起飞 at 2010-12-14 21:02:33:
今天两次菌落PCR，扩出来的片段都不是目的片段。最初P的是菌的16S，用的是通用引物27F和1492R，扩出来1500bp左右的16S片段，然后将PCR产物切胶回收纯化，并且已检测了回收产物，是1500左右。然后做连接，连接到pM ...

做16s你还菌落pcr，你想干嘛？验证有没有连上？没必要啊，跑电泳大小对了就行了，根本不用验证。。。
赞一下(2人) 回复此楼
小木虫之有关部门负责人
4楼2010-12-14 21:59:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

五柳

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by scelab at 2010-12-14 21:59:29:

做16s你还菌落pcr，你想干嘛？验证有没有连上？没必要啊，跑电泳大小对了就行了，根本不用验证。。。

同意楼上
回复此楼
5楼2010-12-14 22:04:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可能是你这个T载体假阳性太高了吧，你选几个蓝斑试试吧，蓝白斑筛选有的时候很不靠谱！
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2010-12-14 22:20:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

梦想起飞

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by scelab at 2010-12-14 21:59:29:

做16s你还菌落pcr，你想干嘛？验证有没有连上？没必要啊，跑电泳大小对了就行了，根本不用验证。。。

我是要测序啊，转化之后蓝白斑筛选，但是白色不是也有假阳性吗？想挑菌做菌落pcr，片段正确的话就挑相应菌落摇菌测序啊。不是这样的吗？
赞一下 回复此楼
7楼2010-12-15 20:56:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

梦想起飞

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ganchao1776 at 2010-12-14 22:20:01:
可能是你这个T载体假阳性太高了吧，你选几个蓝斑试试吧，蓝白斑筛选有的时候很不靠谱！

是吗？我今天也想挑个蓝斑来着，可是做实验是时候糊涂了，还是没挑。不过我又用目的片段的引物扩增了白斑菌落，结果是1500。晕啊！彻底晕了
赞一下 回复此楼
8楼2010-12-15 20:59:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
通用引物退火要在58度以上，就不会扩出乱七八糟的带了。
赞一下(2人) 回复此楼
生命不息，探索不止。
9楼2010-12-15 22:37:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

梦想起飞

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by Arrennew at 2010-12-15 22:37:32:
通用引物退火要在58度以上，就不会扩出乱七八糟的带了。

是吗？这么高啊？好吧……谢谢交流啊！
赞一下 回复此楼
10楼2010-12-17 10:13:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 梦想起飞 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 296求调剂 +14 汪！？！ 2026-04-10 16/800 2026-04-12 10:48 by zhouyuwinner
[考研] 266求调剂，一志愿哈工程电子信息，本科获多项国奖和省奖 +8 lumine1 2026-04-06 8/400 2026-04-11 18:35 by 逆水乘风
[考研] 调剂 +5 文道星台 2026-04-11 5/250 2026-04-11 15:01 by 凯凯要变帅
[考研] 本人女孩 +7 吼吼， 2026-04-10 9/450 2026-04-11 14:45 by ACS Nano——
[考研] 农学0904 312求调剂 +6 Say Never 2026-04-10 6/300 2026-04-11 10:33 by wwj2530616
[考研] 调剂 化学 307 +21 73372112 2026-04-09 23/1150 2026-04-10 23:53 by wj165256
[考研] 求调剂288 +6 ioodiiij 2026-04-10 8/400 2026-04-10 21:07 by zhouxiaoyu
[考研] 一志愿京区985，085401，与本科专业一致，电子信息工程， +4 阳光开朗的男孩 2026-04-10 4/200 2026-04-10 18:27 by shenrf
[考研] 298求调剂 +13 钉叮咚冬瓜 2026-04-09 13/650 2026-04-10 15:49 by jiajinhpu
[考研] 机械专368 有去处吗 +4 种大树 2026-04-10 4/200 2026-04-10 15:31 by jiajinhpu
[考研] 材料调剂 +5 hzhahg 2026-04-06 5/250 2026-04-10 10:10 by may_新宇
[考研] 一志愿中科大070300化学，314分求调剂 +12 wakeluofu 2026-04-09 12/600 2026-04-10 09:57 by liuhuiying09
[考研] 已调剂 +18 柴郡猫_ 2026-04-09 19/950 2026-04-09 22:10 by 柴郡猫_
[考研] 初试分332，一志愿报考西北工业大学， +11 故人?? 2026-04-09 11/550 2026-04-09 21:54 by JineShine
[考研] 284求调剂 +7 让我上岸吧阿西 2026-04-09 7/350 2026-04-09 18:59 by haironglove
[考研] 材料专硕初试分332一志愿西北工业大学， +12 故人?? 2026-04-09 12/600 2026-04-09 18:34 by Ccclqqq
[考研] 086000生物与医药调剂 +7 awwwwwooooo 2026-04-09 7/350 2026-04-09 13:31 by 北极159263
[考研] 一志愿南昌大学，085600，344分求调剂 +11 调剂上岸玘 2026-04-05 12/600 2026-04-08 16:17 by luoyongfeng
[考研] 一志愿哈工大，初试329，求环境科学与工程调剂！ +11 余未辛 2026-04-06 11/550 2026-04-08 15:21 by screening
[考研] 338求调剂 +4 我想上岸ii 2026-04-05 4/200 2026-04-06 21:04 by 木子君1218
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭