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笔冰河

银虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR无条带

双酶切T载体和表达载体后,回收获得目的片段和载体,连接,转化,挑18个单克隆,菌落PCR全部无条带,这是怎么回事,目的片段确定酶切成功,表达载体无法从电泳图上确定是否两个位点都酶切成功(两个酶切位点紧连着)。可能是什么原因呢?
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笔冰河

银虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
: Originally posted by panda73 at 2011-12-20 21:41:26:
载体的处理很重要,你如果不确定载体是否处理完全,可以在做双酶切时,设置类似的单酶切对照,根据质粒带型的变化确定是否在双酶切体系中,两个酶都正常工作了。另外,双酶切时,加的酶量很重要,多了容易star ac ...

谢谢!
10楼2011-12-21 19:38:38
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xhy0016

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
笔冰河(金币+1): 2011-12-20 14:40:56
你为什么不提质粒跑电泳验证一下,而非要直接菌落PCR呢
2楼2011-12-19 19:09:00
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笔冰河

银虫 (小有名气)


西瓜(金币+1): 我也觉得~ 2011-12-27 17:25:42
引用回帖:
: Originally posted by xhy0016 at 2011-12-19 19:09:00:
你为什么不提质粒跑电泳验证一下,而非要直接菌落PCR呢

一般不是都先菌落PCR吗,几十个菌落,提质粒成本太高了,而且还需要过夜摇菌
3楼2011-12-20 08:35:06
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
笔冰河(金币+1): 去磷酸化的条件是什么呢,要自己配溶液吗,还是有试剂盒买 2011-12-20 14:40:34
西瓜(金币+3): Good 2011-12-22 18:34:35
有这么多假阳性?一般我连接载体,阳性率高于90%。只有当PCR直接酶切时候,有部份结果连接错误。所以我觉的还是酶切不完全吧。菌液PCR有做对照吗?如果是阳性一般都有条带。楼主如果不想更改酶切体系,可以试试去磷酸化。
4楼2011-12-20 09:03:18
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