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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌落PCR无条带
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笔冰河

银虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR无条带

双酶切T载体和表达载体后，回收获得目的片段和载体，连接，转化，挑18个单克隆，菌落PCR全部无条带，这是怎么回事，目的片段确定酶切成功，表达载体无法从电泳图上确定是否两个位点都酶切成功（两个酶切位点紧连着）。可能是什么原因呢？
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1楼 2011-12-19 19:02:26
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

panda73

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good！ 2011-12-22 18:35:56
载体的处理很重要，你如果不确定载体是否处理完全，可以在做双酶切时，设置类似的单酶切对照，根据质粒带型的变化确定是否在双酶切体系中，两个酶都正常工作了。另外，双酶切时，加的酶量很重要，多了容易star activity，而加少了，容易导致酶切不完全，连接时出现大量的载体自连，克隆效率很低。根据酶单位的定义，可以大致推算出酶切一定量的质粒DNA应该加多少酶量。有些专门计算双酶切是酶用量的软件。
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笔冰河
9楼2011-12-20 21:41:26
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普通回帖

xhy0016

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
笔冰河(金币+1): 2011-12-20 14:40:56
你为什么不提质粒跑电泳验证一下，而非要直接菌落PCR呢
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2楼2011-12-19 19:09:00
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笔冰河

银虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 我也觉得~ 2011-12-27 17:25:42
引用回帖:
楼: Originally posted by xhy0016 at 2011-12-19 19:09:00:
你为什么不提质粒跑电泳验证一下，而非要直接菌落PCR呢

一般不是都先菌落PCR吗，几十个菌落，提质粒成本太高了，而且还需要过夜摇菌
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3楼2011-12-20 08:35:06
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
笔冰河(金币+1): 去磷酸化的条件是什么呢，要自己配溶液吗，还是有试剂盒买 2011-12-20 14:40:34
西瓜(金币+3): Good 2011-12-22 18:34:35
有这么多假阳性？一般我连接载体，阳性率高于90%。只有当PCR直接酶切时候，有部份结果连接错误。所以我觉的还是酶切不完全吧。菌液PCR有做对照吗？如果是阳性一般都有条带。楼主如果不想更改酶切体系，可以试试去磷酸化。
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4楼2011-12-20 09:03:18
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励应助！很久不见了哈~ 2011-12-22 18:35:06
菌落PCR太不可靠，我一般摇菌提质粒，质粒跑电泳大小合适的话，再做酶切验证，溶液ⅠⅡⅢ都是自己配的，实验都是很麻烦，想走捷径，就有不确定性。祝实验顺利。
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
5楼2011-12-20 10:21:54
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jiying198509

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2011-12-22 18:35:21
可以试试提几个菌的质粒 测一下DNA浓度 如果正常的话 可以做酶切验证不过如果菌落全部正确的话 这可能性很小 建议重新连接
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6楼2011-12-20 13:25:09
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笔冰河

银虫 (小有名气)
降低了退火温度，增加了5个循环，重新挑12个单克隆，全部都有条带，但是很淡，是不是假阳性的概率比较高啊
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7楼2011-12-20 18:59:32
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shaquila

金虫 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): good 2011-12-22 18:35:45
一般条件下，菌液PCR应该很浓的，不会那么淡，但是可以提质粒看看，去磷酸化的酶公司都有卖，就提醒一点，反应完后千万别按说明书说的去抽提纯化，可以直接用反应液连接
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8楼2011-12-20 20:27:41
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笔冰河

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by panda73 at 2011-12-20 21:41:26:
载体的处理很重要，你如果不确定载体是否处理完全，可以在做双酶切时，设置类似的单酶切对照，根据质粒带型的变化确定是否在双酶切体系中，两个酶都正常工作了。另外，双酶切时，加的酶量很重要，多了容易star ac ...

谢谢！
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10楼2011-12-21 19:38:38
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